Оптимизация использования жидкого обработки робот провести высокой пропускной способности вперед химических генетики экран Arabidopsis thaliana
Summary
Высокая пропускная способность экрана синтетических малых молекул было проведено на модели видов растений, Arabidopsis thaliana. Этот протокол, разработанный для обработки жидких робот, увеличивает скорость вперед химических генетики экранов, ускоряя открытие новых малых молекул, затрагивающих физиологии растений.
Abstract
Химические генетики все чаще используется для декодирования черты в растениях, которые могут быть непокорных для традиционных генетика ген избыточности или летальность. Однако низка вероятность синтетических малые молекулы, будучи биоактивные; Таким образом для того, чтобы найти те интерес должен испытываться тысячи молекул. Жидкость, робототехники, которые предназначены для обработки большого количества образцов, увеличивая скорость, с которой химические библиотека может проверяться в дополнение к минимуму/стандартизации ошибка обработки. Для достижения высок объём вперед химических генетики экран библиотеки 50000 малых молекул на Arabidopsis thaliana (арабидопсиса), протоколов с помощью многоканальных жидкость стендовые обработки робот были разработаны, которые требуют минимальный техник участие. С помощью этих протоколов были обнаружены 3 271 малых молекул, что вызвало видимые фенотипические изменения. 1,563 соединений индуцированной коротких корней, 1148 соединений изменения окраски, 383 соединений вызвало корневого волоска и другие, не классифицированы, изменения и 177 соединений препятствует прорастанию.
Introduction
В последние 20 лет исследователи в области биологии растений добились больших успехов с помощью химических генетики подходов, как вперед, так и обратного, улучшение нашего понимания биосинтез клеточной стенки, цитоскелета, биосинтеза гормонов и сигнализации, Геотропизм, патогенез, биосинтез пуриновых и endomembrane торговля1,–2,–3,–4,–5. Использование техники вперед химических генетики позволяет идентифицировать фенотипов интерес и позволяет исследователям понять генотипической основ конкретных процессов. И наоборот обратная химическая генетики ищет химических веществ, которые взаимодействуют с заранее белка цели6. Arabidopsis был на переднем крае этих открытий в биологии растений, потому что его генома мал, сопоставления и с комментариями. Она имеет короткий поколения время, и есть несколько линий мутант/репортер для облегчения идентификации аберрантных субцеллюлярные машин7.
Существует два основных узких мест, которые замедляют прогресс вперед химических генетических экранов, первоначальный процесс отбора и определения целевого объекта соединения интерес8. Основных помощь в увеличении скорости выделения малых молекул является использование автоматизации и автоматизированное оборудование9. Обработка жидких роботы являются отличным инструментом для обработки больших библиотек малых молекул и сыграли важную роль в стимулировании прогресса в биологических наук10. Здесь представлены протокол предназначен для облегчения узкое место, связанное с процессом отбора, способствующих выявлению биоактивные малых молекул быстрыми темпами. Этот метод уменьшает бремя труда и времени от имени оператора, а также снижение экономической стоимости принцип следователь.
К настоящему времени проанализированы наиболее химических библиотек провели между 10000 и 20000 соединений, некоторые с как 150,000 и некоторые с всего лишь 709,11,12,13,14, 15 , 16. Протокол представил здесь был реализован на маленькой молекулы библиотеки 50000 соединений (см. Таблицу материалы), один из больших вперед химических генетики экраны проводятся на Arabidopsis до настоящего времени. Этот протокол соответствует нынешней тенденции к повышению эффективности и скорости относительно вперед химических генетики, особенно что касается обнаружения гербицидов, инсектицидов обнаружения, фунгицид обнаружить, наркотиков, обнаружения и биологии рака17 ,18,19,,2021. Хотя и здесь реализованы с Arabidopsis, этот протокол, может быть легко адаптирована для культур клеток, споры и потенциально даже насекомых в жидкой среде 96-, 384-или 1536-ну пластины. Из-за ее небольшой размер Arabidopsis поддается скрининга в 96 хорошо пластины. Однако распространение семян равномерно среди скважин является проблемой. Рука посева является точной, но трудоемким, и хотя есть устройства, предназначенные для распределять семена в 96-луночных пластин, они являются дорогостоящими для покупки. Здесь мы покажем, как можно обойти этот шаг с только небольшой потери точности.
Общая цель этого метода было сделать скрининг большой химической библиотеки против Arabidopsis более управляемым, без ущерба для точности, через использование жидкого обработки робота. Использование этого метода повышает эффективность работы исследователя, уменьшая время, необходимое для завершения начального разбавления серии управления и последующих фенотипические экраны, позволяя быстро визуализации образцов под микроскопом рассечения и быстрого выявление новых биологически активных малых молекул. Рисунок 1 изображает этот протокол ключевых результатов в 4 этапа.
Рисунок 1: рабочий процесс общего экрана вперед химических генетики. Обзор протокола должен быть описан с некоторые детали для каждого из 4 ключевых шагов. 1: получение химического Библиотека, 2: создание разрежения библиотеки, 3: скрининг пластины, и 4: инкубации и визуализации скрининг пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол предназначен для оказания помощи исследователям в выполнении вперед химических генетики экран на Arabidopsis. Мы предоставляем представитель результаты от экрана 50 000 соединений (рис. 2 и рис. 3), один из крупнейших экранов вперед химических гене?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Jozsef аист, Mitchel Ричмонд, Jarrad Gollihue и Андреа Sanchez для конструктивного и критического обсуждения. Д-р Перри Sharyn для фенотипического фотографий. Этот материал основан на работе, поддержке Национального научного фонда под кооперативного соглашения № 1355438.
Materials
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
Riferimenti
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
- Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
- Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
- De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
- Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
- Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
- Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
- Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
- Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
- Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
- De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
- Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
- Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
- . Seed Handling Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013)
- Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
- Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
- Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).
