Optimera användningen av en flytande hantering Robot att utföra en hög genomströmning fram kemisk genetik skärm av Arabidopsis thaliana.
Summary
En hög genomströmning skärm av syntetiska små molekyler utfördes på den modell växtart, Arabidopsis thaliana. Detta protokoll, som utvecklats för en vätskehantering robot, ökar hastigheten på framåt kemisk genetik skärmar, accelererande upptäckten av nya små molekyler som påverkar växtfysiologi.
Abstract
Kemisk genetik används alltmer att avkoda egenskaper i växter som kan vara motsträviga till traditionella genetik på grund av genen redundans eller dödlighet. Sannolikheten för en syntetisk liten molekyl är bioaktiva är dock låg; Därför måste tusentals molekyler testas för att hitta de av intresse. Vätskehantering robotics system är utformade för att hantera ett stort antal prover, öka hastigheten med vilken ett kemiskt bibliotek kan säkerhetskontrolleras förutom minimera/standardisera fel. Att uppnå en hög genomströmning framåt kemisk genetik skärm av ett bibliotek av 50.000 små molekyler på Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protokoll med hjälp av en bänk flerkanaliga vätska hantering robot utvecklades som kräver minimal teknikern engagemang. Med dessa protokoll upptäcktes 3.271 små molekyler som orsakat synliga fenotypiska förändringar. 1 563 föreningar inducerad korta rötter, 1 148 föreningar ändras färgläggningen, 383 föreningar orsakade rot hår och andra, icke-Kategoriserad, förändringar och 177 föreningar hämmade grobarhet.
Introduction
Under de senaste 20 åren har forskare inom växtbiologi gjort stora framsteg med kemisk genetik metoder, både framåt och bakåt, förbättra vår förståelse av växtcellväggar, cytoskelettet, hormon biosyntes och signalering, gravitropism, patogenes, purin biosyntes och endomembrane människohandel1,2,3,4,5. Anställa framåt kemisk genetik tekniker möjliggör identifiering av fenotyper av intresse och tillåter forskare att förstå den genotypiska underbyggnaden för särskilda processer. Omvänt, omvänd kemisk genetik söker upp kemikalier som samverkar med en förutbestämd protein mål6. Arabidopsis har varit i spetsen för dessa upptäckter i växtbiologi eftersom dess genomet är små, mappas, och kommenterade. Den har en kort generationstid, och det finns flera mutant/reporter rader tillgängliga för att underlätta identifiering av avvikande subcellulär maskiner7.
Det finns två större flaskhalsar som bromsa utvecklingen av framåt kemiska genetiska skärmar, inledande screening process och att fastställa målet för sammansatta av intresse8. Ett större stöd i öka hastigheten på liten molekyl urval är användning av automation och automatiserad utrustning9. Vätskehantering robotar är ett utmärkt verktyg för att hantera stora bibliotek med små molekyler och har varit avgörande för körning framsteg i biologiska vetenskaper10. Det protokoll som presenteras här är utformad för att lindra den flaskhals som är associerad med screeningprocessen, möjliggör identifiering av bioaktiva små molekyler i snabb takt. Denna teknik minskar bördan av arbete och tid på uppdrag av operatören samtidigt också minska den ekonomiska kostnaden för principen prövaren.
Hittills har har de flesta kemiska bibliotek analyseras haft mellan 10 000 och 20 000 föreningar, några med så många som 150 000 och några med så få som 709,11,12,13,14, 15 , 16. protokollet infört häri genomfördes på en liten molekyl bibliotek av 50.000 föreningar (se Tabell för material), en av de större framåt kemisk genetiken skärmar bedrivs på Arabidopsis hittills. Detta protokoll passar med den nuvarande trenden mot ökad effektivitet och hastighet angående framåt kemisk genetik, särskilt som den avser herbiciden upptäckten, insektsmedel upptäckten, fungicid Upptäck, drug discovery och cancerbiologi17 ,18,19,20,21. Men genomförs här med Arabidopsis, skulle detta protokoll, lätt kunna anpassas till cellkulturer, sporer och potentiellt även insekter i flytande medium inom 96 – 384- eller 1536 brunnar. På grund av sin ringa storlek är Arabidopsis mottagliga för screening i plattor med 96. Distribuera fröna jämnt mellan brunnar är dock en utmaning. Hand sådd är korrekt men arbetskrävande, och även om det finns anordningar för att fördela frön i 96 brunnar, de är dyra att köpa. Här visar vi hur detta steg kan kringgås med bara en liten förlust i noggrannhet.
Det övergripande målet med denna metod var att göra screening ett stort kemiska bibliotek mot Arabidopsis mer lätthanterligt, utan att kompromissa med noggrannhet, via användning av en vätskehantering robot. Användningen av denna metod förbättrar effektiviteten av forskaren genom att minska den tid det tar att slutföra första spädningen serie ledning och efterföljande fenotypiska skärmar, möjliggör snabb visualisering av prover i dissekera Mikroskop, och snabb identifiering av nya bioaktiva små molekyler. Figur 1 illustrerar detta protokollets viktigaste resultaten i 4 steg.
Figur 1: övergripande arbetsflödet för skärmen framåt kemisk genetik. En översikt av protokollet att beskrivas med några Detaljer för varje 4 viktiga steg. 1: ta emot kemiska biblioteket, 2: att göra utspädning biblioteket, 3: att göra Screening plåtarna och 4: ruvning och visualisera Screening plattorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll syftar till att hjälpa forskare i att åstadkomma en framåt kemisk genetik skärm på Arabidopsis. Vi tillhandahåller representativa resultat från en skärm av 50.000 föreningar (figur 2 och figur 3), en av de största framtida kemisk genetik skärmarna utförs på Arabidopsis hittills9,13,23. Användning av en vätskehantering robot aktiverat effek…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Jozsef Stork, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue och Andrea Sanchez för konstruktiv och kritisk diskussion. Dr. Sharyn Perry för fenotypisk fotograferar. Detta material bygger på arbete stöds av National Science Foundation under kooperativa avtal nr 1355438.
Materials
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
Riferimenti
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
- Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
- Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
- De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
- Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
- Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
- Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
- Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
- Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
- Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
- De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
- Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
- Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
- . Seed Handling Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013)
- Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
- Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
- Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).
