السريع في فيفو تقييم لقدرات توليد الخلايا اللمفية T السامة للخلايا Adjuvant في لتطوير اللقاحات
Summary
نحن الحاضرين هنا تطبيق لتقنية مناعية قياسية (كفسي الملون OT–أنا انتشار) تهدف إلى رصد سرعة توليد اللمفاويات T السامة للخلايا بوساطة adjuvant (CTL) المجراة في. هذا تقدير سريع لقدرات CTL مفيد لتطوير لقاحات وقائية ضد العوامل الممرضة داخل الخلايا، فضلا عن لقاحات السرطان العلاجية.
Abstract
تقييم لقاحات الوحدة الفرعية الحديثة يكشف عن أن جيل تحييد الأجسام المضادة مهم لكنه غير كاف لتحديد adjuvant. ولذلك، هناك حاجة ماسة في المواد المساعدة مع قدرات المناعية تنشيطية كل خلطيه والخلوية التي تكون قادرة على تعزيز استجابات الخلايا الليمفاوية (CTL) T السامة للخلايا. وهكذا، رصد المؤمنين من المرشحين adjuvant حمل الصليب-فتيلة وتعزز بعد إنشاء CTL يمثل خطوة حاسمة في تطوير اللقاحات. هنا نقدم طلبا لأسلوب يستخدم سيينفيكل على حدة (OT–أنا) خلايا T لرصد الصليب-عرض نموذج مستضد ovalbumin (OVA) في فيفو حضور المرشحين adjuvant مختلفة. ويمثل هذا الأسلوب إجراء اختبار سريع لتحديد المواد المساعدة مع قدرات فتيلة عبر أفضل. انتشار CD8+ تي الخلايا هي إشارة أثمن من فتيلة الصليب وهو أيضا يعتبر ربط العرض التقديمي عبر المستحثة adjuvant. ويمكن تقييم هذه الميزة في مختلف أجهزة المناعة مثل العقد الليمفاوية والطحال. مدى جيل CTL يمكن أيضا رصدها، مما يعطي أفكاراً حول طبيعة محلية (استنزاف العقدة الليمفاوية أساسا) أو استجابة على نطاق المنظومة (العقد الليمفاوية البعيدة و/أو الطحال). يسمح هذا الأسلوب أيضا العديد من التعديلات لاختبار العقاقير التي يمكن أن تمنع محددة العرض التقديمي عبر مسارات، ويوفر أيضا إمكانية استخدامها في سلالات مختلفة من الفئران التقليدية والمعدلة وراثيا. وباختصار، ستكون مفيدة لمختبرات اللقاحات في الصناعة أو في الأوساط الأكاديمية أن تطوير أو تعديل المواد الكيميائية لبحوث اللقاحات وتطوير التطبيق الذي نحن الحاضرين هنا.
Introduction
السامة للخلايا تي اللمفاويات (CTL) حمل اللقاحات هي التدخلات العلاجية الرئيسية التي تم وضعها لمكافحة أنواع معينة من السرطان1. CTL أيضا هامة للقاحات وقائية ضد العوامل الممرضة داخل الخلية2. وعلاوة على ذلك، CTL هي إحدى آليات الدفاع المناعي القليلة نشطة وظيفيا في السكان خطر مثل الولدان3،4 منهم تعتمد أيضا على CTL لمكافحة العدوى الحياة المبكرة5. وفي هذا الصدد، اللقاحات ضد الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) التي تم تطويرها مع أخرى الأعشاب التي لا تثير استجابات CTL (الشب) أدت إلى فشل كامل اللقاح مما يؤدي إلى مضاعفات خطيرة على الإصابات في الرضع6. يمكن عكس هذه الآثار السلبية للتطعيم من CD8+ استجابة الخلية تي7. وقد أثبتنا سابقا أن السيتوكينات الرئيسي (النوع الأول من تداخلين) حظيت ببعض مشجعا من الانترفيرون الجينات (اللدغة) يضع ضروريان للردود CTL التي تولدها هذه المواد8، في جزء منه عن طريق قياس انتشار ت-أنا تي الخلايا بعد التطعيم، واستخدام هذه النتائج كما لوحظ قدر من CTL يحفز القدرات في تمديد مواعيد التطعيم9. قياس انتشار OT–أنا CD8+ تي الخلايا في ماوس المتلقية C57BL/6 نوع البرية (WT) بصبغ إستر (CFSE) سوكسينيميديل كاربوكسيفلوريسسين التخفيف تقدير قدرة adjuvant لقاح لتوليد قوي الصليب-فتيلة سيينفيكل، (الببتيد المناعية المهيمنة من أوفالبومين، البويضات). أشكال مختلفة من هذه التقنية تستخدم على نطاق واسع لتقييم انتشار OT-أنا CD8+ وخلايا CD4 بعد التمديد الثاني+ تي الخلايا. على سبيل المثال، قد استخدمت في غياب السيتوكينات مختارة (كو الفئران) أو لقياس فعالية لقاح بعد استدعاء مستضد في وزن الحيوانات. نحن وضع بروتوكول قصيرة (التجربة 4 أيام) الذي بعد نقل السلبي الملون كفسي OT-أنا CD8+ تي الخلايا، تحصين (الليبي) تحت الجلد تتكون من جرعة واحدة من 50 ميكروغرام البويضات خالية من الذيفان وتستكمل مع اختبار المواد المساعدة ويدار (الشكل 1). متابعة نتائج 48 ساعة بعد التطعيم يوفر دليلاً موثوق بها من قدرة adjuvant على توليد استجابات CTL. بهذه الاستراتيجية، من الممكن لتقييم فاعلية الاستجابة المناعية المحلية في العقدة الليمفاوية تجفيف بعد التحصين، فضلا عن مدى الاستجابة بقياس نشاط CTL في الطحال (أو العقد الليمفاوية البعيدة).
Protocol
Representative Results
Discussion
اللقاحات الحديثة هي من الناحية المثالية متميزة composedof مستضد المنقي والمواد المساعدة، مع إمكانية إضافة نظام توصيل مثل الدهنية أو جسيمات شبيهة بالفيروس، وجسيمات نانوية أو ناقلات حية. أحد جوانب رئيسية عند تصميم لقاح أن تختار adjuvant الصحيح وفقا للاحتياجات السريرية. يمكن أن يتضمن جزء من النطاق ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن مدينون للمساعدين التقنيين لدينا: Bröder شين وحاء شكارليت، الذين ساعدونا خلال الإجراءات التجريبية. تم تمويل هذا العمل جزئيا بمنح الاتحاد الأوروبي (يونيب، والعقد رقم 601738، و TRANSVAC2، العقد رقم 730964)، ومنحة “رابطة هلمهولتز” (هاي-IDR). لم لا تؤثر مصادر تمويل البحوث تصميم وتوليد مخطوطة أو المقرر تقديمها للنشر.
Materials
| BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
| CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
| APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
| BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
| Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
| EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
| Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
| Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
| C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
| OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
| FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
| Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
| PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
| Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
| Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
| RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
| Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
| Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
| Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |
Riferimenti
- Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
- Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
- Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
- Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
- Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
- Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
- Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
- Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
- Ebensen, T., et al. Bis-(3′,5′)-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
- Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
- Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
- Otto, K., Bullock, G. . The Laboratory Mouse. , 555-569 (2004).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).
- Shimizu, S., Bullock, G. . The Laboratory Mouse. , 527-542 (2004).
- Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
- Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -. H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, 109-134 (2012).
- Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
- Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
- Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
- Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
- Last’ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. , 79-85 (2009).
- Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
- Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
- O’Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
- Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
- Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
- Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
- Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).
