En kolorimetriske metode til måling af jernindhold i planter

Summary

Vi præsenterer en enkel og pålidelige protokol til måling af jernindhold i plantevæv ved hjælp af metoden kolorimetriske preussiske Blue.

Abstract

Jern, en af de vigtigste mikronæringsstoffer i levende organismer, er involveret i grundlæggende processer, såsom respiration og fotosyntese. Jernindholdet er temmelig lav i alle organismer, beløber sig i planter til omkring 0,009% af tørvægt. Til dato, er en af de mest præcise metoder til måling af koncentrationen af jern i plantevæv flamme absorption atomic spektroskopi. Men denne fremgangsmåde er tidskrævende og dyrt og kræver specifikke udstyr ikke almindeligt forekommende i anlægget laboratorier. Derfor er der behov for en enklere, men nøjagtige metode, som kan anvendes rutinemæssigt. Metoden kolorimetriske preussiske Blue bruges regelmæssigt til kvalitative jern farvning i dyre- og plantearter histologiske sektioner. I denne undersøgelse tilpasset vi den preussiske blå metode for kvantitative målinger af jern i tobak blade. Vi valideret rigtigheden af denne metode, ved hjælp af både atomare spektroskopi og preussiske Blue farvning for at måle jernindhold i de samme prøver og fundet en lineær regression (R² = 0,988) mellem de to procedurer. Vi konkludere, at den preussiske Blue metode til kvantitativ jern måling i plantevæv er præcise, enkel og billig. Den lineære regression præsenteres her kan imidlertid ikke være hensigtsmæssigt for andre plantearter på grund af potentielle vekselvirkninger mellem prøven og reagenset. Etablering af en regression kurve er således nødvendig for forskellige plantearter.

Introduction

Jern (Fe) er et vigtigt mikronæringsstof i alle levende organismer. I planter er det et essentielt mikronæringsstof¹ på grund af sit engagement i grundlæggende processer, såsom respiration, fotosyntese og klorofyl biosyntesen. Høj ophobning af frit jern ioner er skadeligt at plante celler på grund af reaktioner fører til frigivelse af frie radikaler forårsager oxidativ stress. For at fastholde jern homøostase inden for plante celle, ioner gemmes i vacuoles og afsondret inden for ferritins, protein bure direkte involveret i jern homøostase² og de vigtigste lagerstrukturen af jern i alle levende organismer. På samme tid påvirker jernmangelanæmi en væsentlig del af den menneskelige befolkning, hvilket resulterer i et stigende behov for anlæg Fe biofortification. På grund af de unikke egenskaber af anlægget ferritin tilbyder mad berigelse med ferritin-jern en lovende strategi for at bekæmpe problemet med fejlernæring³.

Jern ioner er hovedsageligt fundet i to oxidation stater, nemlig den jernholdige (divalent Fe^{2 +} eller jern (II)) og jern (trivalent Fe^{3 +} eller jern (III)) former. Flere andre former for jern, såsom jern klynger⁴, findes også i celler. Fe er gemt som jernoxid i celle og naturligvis former hematites (Fe₂O₃) og ferryhidrites ((Fe^{3 +})₂O₃•0.5 H₂O) under fysiologiske forhold⁵. Hydroxider dannet i disse reaktioner, især jern form, har meget lav opløselighed. Opbevaring af jern påvirkes derfor af pH af løsningen og er i vid udstrækning i en solid state over pH 5⁶.

I betragtning af de fattige opløselighed og høj reaktivitet af Fe, skal overførsel blandt plantevæv og organer være forbundet med egnet chelaterende molekyler. Desuden skal sin redox stater mellem jern og jern skemaer¹ kontrolleres. Inden for blade, omkring 80% af jern findes i fotosyntetiserende celler, på grund af dens afgørende roller i elektronen transportsystem, i biosyntesen af cytokromer, der, klorofyl og andre hæm molekyler, og i dannelsen af Fe-S klynger⁷. For jern overskud i cellen, er overskuddet omplantes til vacuole hvor metallet er gemt i ferritin molekyler⁸.

Jern kan måles i plantevæv ved flere metoder, herunder flamme atomic absorption spektroskopi⁹ (Frederiksen) eller kolorimetriske assays¹⁰, førstnævnte er langt mere præcis end sidstnævnte. Frederiksen er en meget præcis teknik, der gør det muligt at bestemme den elementære sammensætning af en stikprøve på grundlag af elektromagnetisk emission af de enkelte elementer. Frederiksen konverterer metalioner til atomic stater ved flamme-opvarmning af stikprøven, fører til ion excitations- og af en bestemt bølgelængde, når en given ion vender tilbage til sin grundtilstand. Emissioner fra de forskellige ioner er adskilt af en monochromator og opdaget af en absorption sensor¹¹. Frederiksen dermed tjener til at sætte direkte tal jern koncentrationer. Andre teknikker til at visualisere jern i biologisk væv er dog tilgængelige. Induktivt koblet plasma-masse spektroskopi (ICP-MS)¹² er en meget præcis teknik til måling af jern og andre sporstoffer, men manglen på udstyr, både for Frederiksen og ICP-MS, er et fælles problem. På den anden side jern måling af kaliumthiocyanat kolorimetri¹³ mangler præcision og ikke at afsløre små variationer mellem prøver. Preussiske blå farvning^14,15,16,17 er en indirekte metode baseret på reaktion af jern kaliumferrocyanid (K₄Fe(CN)₆) med Fe kationer, producerer en stærke blå farve, og bruges til registrering af kvalitative jern i histologiske sektioner af dyre- og plantearter væv.

Metalliske (nul-Valente) jern er sjældne i lithosfæren. Dominerende ikke-kompleksbundet ionisk form af jern i miljøet er hovedsagelig dikteret af mængden af ilt i omgivelserne, med jern jern er relativt mere rigelige i iltfattige miljøer og jern jern overvejende i aerob websteder. Denne sidstnævnte form er også dominerende i meget sure miljøer, selvom de agenser af jernholdige jern oxidation ofte afviger i iltfattige og sure omgivelser¹⁸. Når jern er oploeses i 4% HCl (pH 0) i en aerob miljø, den største del af den fortyndede jern findes som den jern danner (Fe^{3 +})^19,20.

Reaktioner mellem Fe ioner og K₄Fe(CN)₆ er som følger:

Fe^{3 +}: FeCl₃ + K₄Fe(CN)₆ = KFe(III)Fe(II)(CN)₆¯ + 3KCl

Fe^{2 +}: 4 FeCl₂ + 2 K₄Fe(CN)₆ = Fe₄(Fe(CN)₆)₂ + 8 KCl

I den foreliggende undersøgelse spurgte vi om preussiske blå farvning kan være nyttige til måling af jern niveauer i løsning.

I første omgang har vi bekræftet sammenhængen mellem koncentrationen af Fe i vandig opløsning og preussiske blue farvning. Fe (som FeCl₂, FeCl₃ eller en 1:1 blanding af to) koncentration i vandige opløsninger blev målt både atomare spektroskopi og absorbans (OD) efter tilsætning af preussiske blue. Figur 1 viser de lineære regression kurver til målinger ved hver metode. Vi konkluderede, at den preussiske blue metode kan anvendes til kvantitativ analyse af jern koncentration i opløsning.

Figur 1: lineær regressionsanalyse mellem Fe koncentration målt ved Frederiksen og lys absorbans (OD, 715 nm) fremstillet ved den preussiske blue metode. De blå firkanter og linje repræsenterer Fe^{2 +} løsningen, røde firkanter og linje repræsenterer Fe^{3 +} løsning og de sorte firkanter og linje repræsenterer en 1:1 blanding mellem Fe^{2 +} og Fe^{3 +}. De følgende regressioner blev indhentet: [Fe^{2 +}] = 3 + 123 x OD, r = 0.996, R² = 0.989; [Fe^{3 +}] = 1 + 292 x OD, r = 0.999, R² = 0.997; og [Fe^{2 / 3 +}] = 11 + 146 x OD, r = 0.983, R² = 0.956. Fe^{2 +} donor var FeCl₂ og Fe^{3 +} donor FeCl₃. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

For at tilpasse de kolorimetriske preussiske blue metode til kvantitativ jern analyse af plantevæv, blev jernindhold af tobak blad aske målt af flamme absorption atomic spektroskopi og preussiske blue farvning. Der var god korrelation mellem resultaterne fra de to teknikker.

Protocol

1. plante materiale og vækstbetingelser Frø en tobak (kultivar Samsun) frø pr. 5 cm x 5 cm gryde fyldt med standard pot medium. Placer potterne på bakker. Dyrke planter i en vækst værelse på lang dag betingelser (16/8 h lys/mørk) ved en konstant temperatur på 23 ° C. Vande med postevand indtil vand afløb fra puljen. Efter 50±5 dage, skal du starte Fe behandlinger i vanding, ifølge de fusioner, eksperimentet. For eksempel, anvendte vi en række jern koncentrationer fra 0 til 6 mM, supplere…

Representative Results

Når denne protokol er udført korrekt, bør man få fremragende korrelation mellem resultaterne opnået ved de preussiske blue og atomic spektroskopi metoder. Derfor, metoden preussiske blue kan nemt bruges til at opnå en nøjagtig måling af jern koncentration i planten prøver, som afspejlet i de følgende eksperiment. Tobaksplanter blev dyrket som beskrevet i protokollen og vandes med vand indeholdende forskellige jern konc…

Discussion

Jern måling i plantevæv er meget vigtige for at vurdere virkningerne af kunstvanding eller andre miljøforhold. Her, beskrev vi en nem og præcis kolorimetriske metode til Fe indhold måling i tobaksblade, der let kan tilpasses til andre plantearter og væv.

I at optimere betingelserne for den kolorimetriske metode, brugte vi en lav pH medium (pH < 1,0) for at tillade jern opløselighed. Brændingen var udført at frigive alle former for jern og sikre, at ingen forurenende stoffer i prøvern…

Materials

Potassium Hexacyanoferrate(II)	Fisher Chemical	14459-95-1	Reagent for the Pussian Blue
Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 μm	Millec	SLGP033RS	Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution
Scintillation Vials	Fisherbrand	03-337-4	Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure.
Disposable Syringe 10 ml	Medi-Plus	1931	Syringe used during the filtration
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	231-595-7	Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials
Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN	Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab	Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407.	Tobacco cultivar used in this protocol
Glass Wool (Rock Wool)	Sigma-Aldrich	659997-17-3	Used in the procedure of burning samples in the furnace.