इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य प्लाज्मिड डीएनए पर परिभाषित डीएनए-प्रोटीन crosslinks की मरंमत को बढ़ाता है । क्षतिग्रस्त plasmids प्राप्तकर्ता स्तनधारी सेल लाइनों और कम आणविक कई समय अंक पोस्ट-अभिकर्मक में काटा वजन में transfected हैं । डीएनए मरंमत कैनेटीक्स कतरा-विशिष्ट प्राइमर qPCR के बाद विस्तार का उपयोग कर quantified हैं ।
इस विधि का उद्देश्य स्तनधारी सेल लाइनों में डीएनए-प्रोटीन crosslink (डीपीसी) की मरम्मत की कैनेटीक्स की जांच करने के लिए एक लचीला, तेजी से और मात्रात्मक तकनीक प्रदान करना है । बल्कि विश्व स्तर पर xenobiotic-प्रेरित या सहज गुणसूत्र डीपीसी हटाने के हटाने की परख, इस परख एक सजातीय, रासायनिक परिभाषित घाव विशेष रूप से एक प्लाज्मिड डीएनए सब्सट्रेट के भीतर एक साइट पर शुरू की मरंमत की जांच । महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण रेडियोधर्मी सामग्री के उपयोग से बचा जाता है और महंगा या अत्यधिक विशेष प्रौद्योगिकी पर निर्भर नहीं है । इसके बजाय, यह मानक रिकॉमबिनेंट डीएनए प्रक्रियाओं और व्यापक रूप से उपलब्ध वास्तविक समय, मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) इंस्ट्रूमेंटेशन पर निर्भर करता है । उपयोग की रणनीति के अंतर्निहित लचीलापन को देखते हुए, crosslinked प्रोटीन के आकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रासायनिक संपर्क की प्रकृति और लगाव साइट के सटीक डीएनए अनुक्रम संदर्भ इन के संबंधित योगदान का पता करने के लिए विविध किया जा सकता है डीपीसी की मरंमत की समग्र दक्षता के लिए मानदंड । इस विधि का प्रयोग, एक साइट विशिष्ट डीपीसी युक्त plasmids कोशिकाओं में transfected और कम आणविक वजन डीएनए विभिंन बार पोस्ट-अभिकर्मक पर बरामद किया गया । बरामद डीएनए तो कतरास-विशिष्ट प्राइमरी एक्सटेंशन (SSPE) प्लाज्मिड के क्षतिग्रस्त किनारा के पूरक एक प्राइमर का उपयोग करने के अधीन है । चूंकि डीपीसी घावों Taq डीएनए पोलीमरेज़ ब्लॉक, संयुक्त राष्ट्र की मरंमत डीएनए को मरंमत के अनुपात मात्रात्मक qPCR का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । सायकल थ्रेशोल्ड (सीटी) मान संबंधित कक्ष पंक्तियों में विभिन्न समय बिंदुओं पर प्रतिशत सुधार की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है । इस SSPE-qPCR विधि का उपयोग किसी भी डीएनए adduct की मरंमत कैनेटीक्स को मात्रात्मक आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है जो Taq पोलीमरेज़ को रोकता है ।
यहां वर्णित एक पीसीआर आधारित परख SSPE-qPCR है । इस विधि का उद्देश्य मरंमत कमी और कुशल स्तनधारी कोशिकाओं में प्लाज्मिड डीएनए transfected पर डीपीसी मरंमत मात्रा है । इस परख तेजी से है, मात्रात्मक, अत्यंत लचीला है, और सीधे उपायों की मरंमत गतिविधि । हालांकि इस रिपोर्ट DPCs की मरंमत का अध्ययन करने के लिए इस पद्धति के उपयोग पर केंद्रित है, नीचे प्रस्तुत परिणाम वर्णन है कि किसी भी घाव है कि ब्लॉक Taq पोलीमरेज़ इस पद्धति का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है की मरंमत ।
इस विधि के विकास के पीछे तर्क के माध्यम से जो स्तनधारी कोशिकाओं की मरंमत DPCs तंत्र में अंतर्दृष्टि लाभ है । डीएनए क्षति के अंय प्रकार के विपरीत, DPCs बड़े पैमाने पर1,2विविध रहे हैं । अध्ययनों से यह प्रदर्शित किया है कि सेलुलर प्रोटीन के सैकड़ों डीएनए के लिए crosslinked बन सकता है और है कि प्रत्येक प्रोटीन के लिए वहां सिद्धांत में हैं, कई एमिनो एसिड की ओर जंजीरों कि सेलुलर डीएनए से जुड़ी covalently हो सकता है3। इसके अलावा, वहां कई न्यूक्लियोटाइड ठिकानों पर के रूप में अच्छी तरह के रूप में ribose चीनी4,5पर कई पदों सहित डीएनए रीढ़ की सतह पर प्रोटीन के लिए रासायनिक लगाव अंक हैं । इस रासायनिक विविधता संभावना है कि विशिष्ट जैव रासायनिक मार्ग DPCs के विभिंन प्रकार की मरंमत पर भरोसा किया जा सकता है उठाती है । यह मन में इस चिंता के साथ था कि SSPE-qPCR की परख विकसित हो गई थी.
कई तकनीकों के लिए सेलुलर डीपीसी मरंमत के आण्विक जीवविज्ञान में अंतर्दृष्टि लाभ विकसित किया गया है । निंनलिखित प्रमुख दृष्टिकोण है कि विकसित किया गया है की एक सिंहावलोकन प्रदान करता है, प्रमुख शक्तियों और कमजोरियों का एक सारांश के साथ प्रत्येक अधिकारी । यह है कि जब इस सारांश स्तनधारी सेल संस्कृति प्रणालियों, डीपीसी की मरंमत के मौजूदा मॉडल के लिए महत्वपूर्ण योगदान में डीपीसी की मरंमत के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित करने लायक है माइक्रोबियल और सेल मुक्त सिस्टम है कि इस में चर्चा नहीं कर रहे है का उपयोग कर बनाया गया है पांडुलिपि.
शायद आसान रणनीति है कि डीपीसी की मरंमत की आनुवंशिकी में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए लिया जा सकता है कोशिका मौत के लिए संबंधित संवेदनशीलता का आकलन है जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती एजेंटों को उजागर कोशिकाओं है कि प्रेरित DPCs6,7में मनाया । इस रणनीति अपेक्षाकृत तेजी से, सस्ती है, और बुनियादी सेल संस्कृति तकनीक प्रदर्शन करने की क्षमता से परे विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है । प्रतिसंतुलन ये फायदे निम्नलिखित सहित इस दृष्टिकोण के लिए कई सीमाएं हैं । सबसे पहले, परख सीधे डीएनए की मरंमत का उपाय नहीं है । काम इस रणनीति अंतर्निहित धारणा यह है कि डीएनए क्षति का एक संचय में प्रासंगिक डीएनए की मरंमत प्रोटीन परिणाम एंकोडिंग जीन में उत्परिवर्तनों को निष्क्रिय है कि कोशिका मौत क्रमादेशित चलाता है । हालांकि, गैर एंकोडिंग जीन में उत्परिवर्तन-डीएनए मरंमत प्रोटीन, प्रिंसिपल में, xenobiotic-प्रेरित सेल मौत को बढ़ाने (या कम) सेलुलर संवेदनशीलता सकता है । दूसरा, एजेंटों कि बनाने DPCs हमेशा डीएनए क्षति के अंय प्रकार के प्रेरित (एक अपवाद है 5-aza-2′-deoxycytadine, लेकिन इस एजेंट भी सेलुलर methyltransferase स्तर घट जाती है8) । नतीजतन, यह है कि बढ़ाया सेलुलर सवाल में एजेंट के लिए अतिसंवेदनशीलता किनारा crosslinks या अंय घावों की मरंमत में दोष को प्रतिबिंबित कर सकते है गर्भ धारण है । तीसरा, के रूप में ऊपर उल्लेख किया गया था, DPCs एक बेहद विषम रासायनिक crosslinks के विभिंन प्रकार के शामिल वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं, विभिंन प्रोटीन भागीदारों को शामिल । यह संभव है कि एक या एक से अधिक उप-प्रकार के इन घावों की मरंमत एक विशेष आनुवंशिक पृष्ठभूमि में बदला जा सकता है, यह अंतर काफी इस एजेंट द्वारा प्रेरित मौत के लिए सेलुलर अतिसंवेदनशीलता को बदलने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । सारांश में, जबकि इस रणनीति एक आकर्षक प्रारंभिक बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है, ऊपर उल्लिखित सीमाओं को आगे बढ़ाने के महत्व पर प्रकाश डाला, और अधिक सीधे तरीके डीपीसी मरंमत के कैनेटीक्स अध्ययन ।
इस उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए कई संबंधित दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं । उदाहरण के लिए, जांचकर्ताओं ‘ मुक्त ‘ डीएनए और ‘ प्रोटीन बंधे ‘ डीएनए9,10,11के बीच अंतर करने के लिए तरीके विकसित किया है । इन तरीकों का उपयोग करना, यह संभव है DPCs के स्थिर राज्य स्तर या एक डीपीसी के लिए निंनलिखित प्रदर्शन-अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि में एजेंट के उत्पादन की तुलना । दो रणनीतियों है कि सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है डीपीसी-मुक्त डीएनए से युक्त डीएनए या तो एक nitrocellulose झिल्ली बाध्यकारी रणनीति या KCl/एसडीएस वर्षण12,13का उपयोग कर अलग शामिल । पूर्व में दृष्टिकोण कोशिकाओं लीजड ड रहे है और एक nitrocellulose फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया । क्योंकि nitrocellulose बांधता प्रोटीन, फिल्टर प्रोटीन से जुड़े डीएनए, मुक्त डीएनए के माध्यम से पारित करने की अनुमति बरकरार रखती है । उत्तरार्द्ध रणनीति प्रोटीन बंधे डीएनए में इस तथ्य के आधार पर नि: शुल्क डीएनए से अलग है कि एसडीएस प्रोटीन के लिए बांध नहीं बल्कि डीएनए, और KCl के अलावा द्वारा उपजी जा सकता है । नतीजतन, प्रोटीन से जुड़े डीएनए अघुलनशील हो जाता है, जबकि असीम डीएनए समाधान में रहता है । डीपीसी युक्त डीएनए तो radiolabeled thymidine का उपयोग कर quantitated जा सकता है (यदि कोशिकाओं शुरू में चयापचय लेबल थे) या एक डीएनए द्वारा ३३२५८ Hoechst तरह फ्लोरोसेंट डाई चयनात्मक । इन विधियों reproducible है और चरणों की एक छोटी संख्या की आवश्यकता है । हालांकि, वे रासायनिक crosslink के माध्यम से जो प्रोटीन डीएनए से जुड़ा हुआ है की प्रकृति के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते । इसके अलावा, यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है, इन परख खत्म हो सकता है झूठी मरंमत स्कोरिंग द्वारा डीपीसी की मरंमत का अनुमान है, अर्थात्, proteolytic प्रसंस्करण छोटे डीएनए-पेप्टाइड crosslinks कि के रूप में आसानी से फंस या उपजी नहीं हो सकता है, के रूप में बोनाी डीएनए मरम्मत.
धूमकेतु परख कोशिकाओं में डीपीसी गठन की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है14। इन प्रयोगों में DPCs की उपस्थिति से डीएनए माइग्रेशन घट जाता है जो proteinase बादशाह के साथ फिर से इलाज करने से उलट सकता है । इसलिए, पूंछ की लंबाई डीपीसी गठन का अनुमान लगाया जा सकता है । हालांकि, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, डीपीसी बनाने दवाओं डीएनए क्षति के अंय प्रकार है जो पूंछ लंबाई बदल सकता है बनाएं । इस प्रोटोकॉल भी उच्च तकनीकी है और फोकल इमेजिंग में विशेषज्ञता और प्रशिक्षण की आवश्यकता है ।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री crosslinking एजेंटों15,16,17के साथ उपचार के बाद डीपीसी मरंमत कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ये प्रयोग डीपीसी बनाने वाले एजेंटों के साथ कोशिकाओं का इलाज करते हैं और बायोटिन कैप्चर या phenol: क्लोरोफॉर्म (1:1) निष्कर्षण के माध्यम से DPCs को अलग करते हैं । मास स्पेक्ट्रोमेट्री तो crosslinked प्रोटीन की पहचान या समय के साथ गठन DPCs की मात्रा quantitate इस्तेमाल किया जा सकता है । इस दृष्टिकोण का प्रमुख लाभ उत्पादित डेटा की प्रकृति है । यह ठीक प्रोटीन है कि एक xenobiotic के लिए जोखिम के बाद crosslinked हो के प्रकार सूची में संभव है, तथापि, इस प्रोटोकॉल महंगा है, समय लगता है, और crosslink के प्रकार है कि पता लगाया जा सकता द्वारा सीमित है ।
Maizels एट अल. एक संवेदनशील ‘ रडार ‘ (तेजी से डीएनए adduct वसूली के लिए दृष्टिकोण) परख डीएनए के quantitate immunodetection प्रोटीन adducts के रूप में अच्छी तरह से एक एलिसा आधारित रडार परख18,19के लिए विकसित की है । इन परख विशेष रूप से डीएनए में फँसाने के लिए उपयोगी प्रोटीन मध्यवर्ती कि क्षणिक कोशिकाओं में फार्म और नए प्रोटीन adducts की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त नमूने उत्पन्न. इस immunodetection परख एंटीबॉडी की उपलब्धता पर निर्भर करता है डीएनए-प्रोटीन crosslink पर कब्जा है और इसलिए, अपमानित डीएनए-पेप्टाइड adducts कि मरंमत के दौरान फार्म का पता लगाने में सक्षम नहीं हो सकता है । हाल ही में, एक विशिष्ट डीपीसी मरंमत मार्ग डीएनए प्रतिकृति और एक डीएनए पर निर्भर metalloprotease संयम से जुड़ा हुआ है जिसमें DPCs की मरंमत के दौरान छोटे पेप्टाइड्स के लिए proteolyzed कर रहे है की खोज की थी20,21। इस जीन में विरासत में मिला उत्परिवर्तनों Ruijs-Aalfs सिंड्रोम के साथ जुड़े रहे है मनुष्यों में, एक जीनोमिक अस्थिरता, समय से पहले उंर बढ़ने की विशेषता रोग, और लीवर कैंसर22। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर संयमी जीन दोष के साथ चूहों इसी तरह phenotypes23प्रदर्शन ।
transcriptional गतिविधि के मेजबान सेल पुनः सक्रियण transfected प्लाज्मिड डीएनए सब्सट्रेट24,25पर मौजूद परिभाषित घावों की मरंमत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इन प्रयोगों में, प्लाज्मिड युक्त DPCs (या अन्य प्रकार के डीएनए घावों) कि एक रिपोर्टर की प्रतिलिपि ब्लॉक, जैसे luciferase, कोशिकाओं में transfected हैं. Luminescence माप लिया 24-72 ज बाद में फिर डीपीसी मरंमत के साथ संबंधित हैं । हालांकि, इन अप्रत्यक्ष मरंमत परख 24 एच पोस्ट अभिकर्मक से पहले की मरंमत की घटनाओं का पता लगाने में असमर्थ है और आरएनए पोलीमरेज़ बाईपास आंशिक रूप से मरंमत सब्सट्रेट और पूर्ण मरंमत के बीच भेद नहीं कर सकता ।
ऊपर वर्णित तरीकों में से प्रत्येक लाभ है और डीपीसी की मरंमत के मौजूदा मॉडल के लिए योगदान दिया है । हालांकि, SSPE-qPCR परख इन अंय दृष्टिकोण के साथ जुड़े सीमाओं के कई दरकिनार और फलस्वरूप डीपीसी मरंमत तंत्र में और अधिक विशिष्ट अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, SSPE-qPCR परख सीधे साइट की मरंमत बरकरार स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए पर विशिष्ट DPCs उपाय कर सकते हैं । इस विधि बहुमुखी है और करने के लिए उपयोग किया गया है मरंमत अभिकर्मक हंसटर और मानव कोशिका लाइनों में निंनलिखित परिणाम प्राप्त करते हैं । प्लाज्मिड के अभिकर्मक lipofection या electroporation का प्रयोग कल्चरल स्तनधारी सेल लाइंस में किया जा सकता है । यह भी सुनिश्चित करता है कि केवल परिभाषित DPCs की मरंमत मापा जाता है, और नहीं डीएनए के अंय प्रकार के सबसे डीपीसी द्वारा प्रेरित नुकसान-एजेंटों के गठन । SSPE-qPCR प्रदर्शन करने के लिए आसान है, सस्ती, और तेजी से । इस परख का उपयोग कर प्राप्त परिणामों के रूप में 2 एच पोस्ट अभिकर्मक के रूप में जल्दी मरंमत घटनाओं का पता चला है । इस विधि का प्रयोग, चर कि डीपीसी मरंमत परिणामों को प्रभावित कर सकते है एक तरह से है कि संवेदनशील और कुशल है में अध्ययन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, डीपीसी की मरंमत में प्रतिलेखन की भूमिका अभी तक कड़ाई से मूल्यांकन किया जाना है । SSPE-qPCR परख के लचीलेपन के कारण, crosslinking साइट डीपीसी के इस सवाल का पता करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है । इसके अलावा, डीपीसी असर प्लाज्मिड में प्रतिकृति के एक मूल का परिचय डीपीसी मरंमत पर प्रतिकृति के प्रभाव का पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, एकाधिक crosslinks प्लाज्मिड पर एक एकल डीपीसी बनाम एकाधिक crosslinks की मरंमत में अंतर की जांच करने के लिए बनाया जा सकता है । ये सवाल है कि गुणसूत्र डीएनए का उपयोग कर जवाब मुश्किल होगा रहे हैं, लेकिन आसानी से SSPE-qPCR परख का उपयोग कर संबोधित किया जा सकता है । कुल मिलाकर, SSPE-qPCR परख एक ज्ञात स्थान के घावों से युक्त माइक्रोग्राम मात्रा में शुद्ध, प्लाज्मिड डीएनए की आवश्यकता है । डीपीसी के अलावा Adducts इस परख में इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, घाव Taq पोलीमरेज़ द्वारा विस्तार अवरुद्ध करने में सक्षम होना चाहिए ।
SSPE-qPCR विधि एक समरूप जनसंख्या युक्त एक एकल, परिभाषित डीपीसी घावों की मरंमत की जांच करके अंय दृष्टिकोण पर कई लाभ प्रदान करता है । यह उल्लेखनीय है कि प्रोटीन की पहचान को नियंत्रित करने और डीएनए के लिए प्रोटीन से कनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया रासायनिक crosslink के प्रकार के अलावा, यह आसानी से अनुक्रम संदर्भ जिसमें डीपीसी घाव पेश किया है हेरफेर करने के लिए संभव है । हम या तो टेंपलेट या एक सक्रिय मोटर लोकस के एक प्लाज्मिड बहाव के किनारा कोडिंग पर घाव शुरू करने की डीपीसी मरंमत पर प्रभाव का पता लगाया है । इसी तरह, हम एक M13 प्लाज्मिड का उपयोग कर प्रतिकृति की मरंमत पर प्रभाव की जांच की प्रक्रिया में है HEK293T कोशिकाओं में प्रतिकृति transfected के एक SV40 मूल युक्त । परख बताया इस के साथ साथ सीधे डीपीसी मरंमत के उपाय, जैसे मेजबान सेल पुनर्सक्रियन कि परोक्ष रूप से मरंमत गतिविधि24,25का अनुमान के रूप में अंय रणनीतियों के खिलाफ । इसके अलावा, प्रणाली मजबूत, संवेदनशील, और मात्रात्मक है । अंय प्रणालियों, जो डीपीसी हटाने के उपाय के विपरीत, इस परख केवल पूरी मरंमत की घटनाओं का पता लगाता है, यानी, यह केवल कि डीपीसी घावों को हटा दिया जाना चाहिए, लेकिन है कि द्वैध डीएनए की अखंडता पूरी तरह से17बहाल हो । इसका कारण यह है abasic साइटों और निक या phosphodiester रीढ़ में टूटता है परख ब्लॉक के रूप में प्रभावी रूप से मूल डीपीसी घाव29के रूप में ।
हालांकि इस रिपोर्ट के एक विशेष प्रकार की डीपीसी पर केंद्रित है, जो एक एंजाइम रिएक्शन मध्यवर्ती के borohydride फँसाने के द्वारा बनाई गई थी, हम वर्तमान में अंय प्रोटीन और घावों जिसमें प्रोटीन के संबंध को शामिल DPCs की मरंमत का अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण विकसित कर रहे है डीएनए nucleoside आधार के माध्यम से होता है, बजाय ribose स्थिति से । प्रतिवाहिनी अमीना का उपयोग कर, हमने प्रोटीन और पेप्टाइड crosslinks एक डीएनए प्राइमरी30के guanine या cytosine आधार से जुड़ा बनाया है । ये oligonucleotides सजातीयता को शुद्ध कर रहे थे और डीएनए-प्रोटीन और डीएनए-पेप्टाइड crosslinks युक्त supercoiled plasmids उत्पन्न करते थे. हालांकि इन प्रतिक्रियाओं की दक्षता कुछ हद तक oxoguanine glycosylase crosslink दृष्टिकोण की है कि इसके बाद के संस्करण विस्तार से वर्णित के सापेक्ष कम है, वे फिर भी सफल रहे थे और जंगली में इन सब्सट्रेट की मरंमत प्रकार की परीक्षा की अनुमति और न्यूक्लियोटाइड की मरंमत की कमी स्तनधारी सेल लाइनों । हमने oxoguanine घावों और एक सिंथेटिक ribose-कोलेस्ट्रॉल संयुग्मी की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए SSPE-qPCR की परख का भी उपयोग किया है, जिसे पहले सेलुलर न्यूक्लियोटाइड एक्साइज रिपेयर मशीनरी के माध्यम से मरम्मत के लिए दिखाया गया था31. के रूप में चित्रा 2 रेखांकन, किसी भी घाव की मरंमत कि ब्लॉक प्राइमर विस्तार Taq पोलीमरेज़ द्वारा, सिद्धांत रूप में, SSPE-qPCR परख का उपयोग कर मापा जा सकता है ।
डीपीसी मरम्मत के वर्तमान मॉडल सुझाव है कि बड़े DPCs (> 10 केडीए) को हटाने से पहले छोटे पेप्टाइड घाव करने के लिए proteolytic प्रसंस्करण के अधीन हैं32,33,34. सबसे अधिक संभावना इस प्रोटियोलिसिस के लिए जिंमेदार उंमीदवारों proteasome या मानव संयमी20,21,35,36,37, में नामित कोशिकाओं में एक विशेष चिढ़ाते हैं 38. इन की भूमिकाओं में आगे की जांच के लिए SSPE-qPCR परख का उपयोग कर आयोजित किया जा सकता है । Proteasome अवरोधकों डीपीसी युक्त सब्सट्रेट के साथ अभिकर्मक करने से पहले कोशिकाओं का इलाज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, संयमी पछाड़ना सेल लाइनों को क्षतिग्रस्त plasmids के साथ transfected बड़ा प्रोटियोलिसिस के DPCs में अपनी भूमिका स्पष्ट जा सकता है ।
crosslink या डीएनए घावों की प्रकृति के बनाने के लिए इस्तेमाल किया विधि के बावजूद, यह SSPE-qPCR पद्धति गंभीर रूप से सजातीय डीपीसी-प्लाज्मिड सब्सट्रेट की पर्याप्त मात्रा में उत्पन्न करने की क्षमता पर निर्भर है कि तनाव के लायक है । इस विश्लेषण के लिए आवश्यक कदम covalently की शुद्धि, बंद-परिपत्र प्लाज्मिड निंनलिखित प्राइमर विस्तार के लिए किसी भी निक या रैखिक प्लाज्मिड अणुओं को खत्म करने में शामिल हैं । इन संदूषणों को सुनिश्चित करने के लिए समाप्त किया जाना चाहिए कि किसी भी बाद डीपीसी की मरंमत मनाया निक निर्देशित या डबल-किनारा तोड़-निर्देशित मरंमत प्रक्रियाओं के कारण नहीं है । supercoiled डीएनए की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए विफलता निम्न प्राइमरी एक्सटेंशन प्रतिक्रियाओं को oligonucleotide का अनुपात अलग से एकल-असहाय डीएनए से दूर किया जा सकता है । SSPE-qPCR विधि के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम, प्लाज्मिड के लिए प्रोटीन की crosslinking क्षमता है । इस अध्ययन में, एक कुशल, एंजाइमी प्रतिक्रिया एक 8-oxo-guanine घावों को oxoguanine glycosylase प्रोटीन crosslink के लिए इस्तेमाल किया गया था । उप इष्टतम crosslinking की प्रतिक्रिया में जोड़ा प्रोटीन की मात्रा में अलग से सुधार किया जा सकता है ।
हालांकि इस रिपोर्ट में वर्णित परिणाम lipofection पर भरोसा करने के लिए प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में डीपीसी मरंमत सब्सट्रेट परिचय, वहां कोई कारण नहीं है, एक प्राथमिकताओं, अंय transfections तरीकों कार्यरत नहीं किया जा सकता है । हम प्रारंभिक अध्ययन किया है और कहा कि electroporation39 भी इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, यह ध्यान देने योग्य बात है कि हमारे अनुभव में, electroporation अभिकर्मक क्षमता lipofection की तुलना में कम है, और हम यह आवश्यक वाहक डीएनए का उपयोग करने के लिए पाया (5 µ g) के अलावा में 1.5 µ जी की डीपीसी सब्सट्रेट मरंमत डेटा प्राप्त करने के लिए । कुल मिलाकर, SSPE-qPCR विधि ऊपर वर्णित एक अभिनव तरीका है विशेष रूप से प्लाज्मिड डीएनए पर डीपीसी की मरंमत की जांच और डीएनए क्षति प्रतिक्रिया में नई अंतर्दृष्टि उत्पंन प्रदान करता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (ES023350) द्वारा वित्त पोषित किया गया । लिसा Chesner प्रशिक्षण अनुदान 5T32HL007741 द्वारा समर्थित है । हम नतालिया Tretyakova (मिनेसोटा विश्वविद्यालय) और आशीष बसु (कनेक्टिकट विश्वविद्यालय) और उनके इस काम के प्रारंभिक और मध्यवर्ती चरणों के दौरान समर्थन और तकनीकी सलाह के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों को धंयवाद ।
8-oxoguanine modified oligo | Midland Certified Reagent Company | NA | Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’ |
T4 PNK | NEB | M0201S | |
Single-stranded M13 | NEB | N4040S | |
Taq polymerase | NEB | M0267L | |
ATP, 100mM | Thermo Scientific | R0441 | |
dNTP Mix, 10mM each | Thermo Scientific | R0192 | |
BSA | NEB | B9001S | |
T4 polymerase | NEB | M0203L | |
T4 ligase | NEB | M0202L | |
β-agarase | NEB | M0392S | |
Oxoguanine glycosylase 1 | NEB | M0241S | |
SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | green PCR master mix |
Primer R | UMN Genomic Center | NA | 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’ |
Primer L | UMN Genomic Center | NA | 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’ |
Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-012 | transfection reagent |
BspD1 | NEB | R0557S | |
NEB buffer 2 | NEB | B7002S | |
StepOnePlus Real Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
Chloroform, reagent ACS, spectro grade | ACROS | 40463-5000 |