Målet med detta protokoll är att kvantifiera reparation av definierade DNA-protein antipyridinantikropp på plasmid DNA. Bort plasmider är transfekterade till mottagarens däggdjursceller linjer och lågmolekylärt skördas på flera tid punkter efter transfection. DNA reparation kinetik kvantifieras med hjälp av strand-specifik primer filändelsen följt av qPCR.
Syftet med denna metod är att ge en flexibel, snabb och kvantitativa teknik för att undersöka kineticsen av DNA-protein crosslink (DPC) reparation i däggdjursceller linjer. Snarare än globalt testmetoder borttagning av xenobiotiska-inducerad eller spontana kromosomala DPC borttagning, undersöker denna analys reparation av en homogen, kemiskt definierade lesion specifikt infördes på en plats inom en plasmid DNA substrat. Allt detta tillvägagångssätt undviker användningen av radioaktiva ämnen och är inte beroende av dyra eller specialiserad teknik. Istället, det bygger på standard rekombinant DNA förfaranden och allmänt tillgängliga i realtid, kvantitativa polymerasen kedjar reaktion (qPCR) instrumentering. Med tanke på den inneboende flexibiliteten i strategin utnyttjas, storleken av tvärbunden protein, samt arten av den kemiska kopplingen och precisa DNA kan sekvens ramen för webbplatsen fastsättning varieras för att åtgärda dessa respektive bidrag parametrar till den övergripande effektiviteten i DPC reparation. Med den här metoden plasmider som innehåller en sitespecifik DPC var transfekterade celler och låg molekylvikt DNA återhämtade sig vid olika tillfällen efter transfection. Återvunna DNA utsätts sedan för strand-specifik primer filändelsen (SSPEN) med en primer som komplement till den skadada delen av Plasmiden. Sedan den DPC lesion block Taq-DNA-polymerasen, kan förhållandet mellan reparerade till un-reparerade DNA kvantitativt bedömas med qPCR. Tröskelvärden för cykel (CT) används för att beräkna procent reparera vid olika tidpunkter i respektive cell linjer. Specialföretaget för värdepapperisering-qPCR metoden kan också användas att kvantitativt bedöma reparation kinetik av någon DNA addukt att block-Taq-polymeras.
Beskrivs häri kallas en PCR-baserad analys SSPEN-qPCR. Syftet med denna metod är att kvantifiera DPC reparation på plasmid DNA transfekterade in reparation bristfällig och kunnig däggdjursceller. Denna analys är snabb, kvantitativa, extremt flexibel och direkt åtgärder reparera aktivitet. Medan rapporten fokuserar på användning av denna metod att studera reparation av DPC-anrop, illustrerar resultat som presenteras nedan att reparation av någon lesion som blockerar Taq polymeras kan studeras med hjälp av denna metod.
Logiken bakom utvecklingen av denna metod är att få insikt i de mekanismer genom vilka däggdjursceller reparera DPC-anrop. Till skillnad från andra typer av DNA-skador är DPC-anrop kraftigt skiftande1,2. Studier har visat att hundratals av cellulära proteiner kan bli tvärbundna till DNA och som för varje protein det finns i princip många aminosyra sida kedjor som kunde bli kovalent kopplade till cellulär DNA3. Dessutom finns det många kemiska fästpunkter för proteiner på DNA ryggraden, inklusive flera positioner på nucleotide baser samt på ribos socker4,5. Denna kemiska mångfald väcker utsikten att olika biokemiska vägar kan åberopas för att reparera olika typer av DPC-anrop. Det var med denna oro i sinnet att Specialföretaget-qPCR analysen utvecklades.
Flera tekniker har utvecklats för att få inblick i molekylärbiologi av cellulära DPC reparation. Följande ger en översikt över de stora strategier som har utvecklats, med en sammanfattning av stora styrkor och svagheter varje äga. Det är värt att betona att medan denna sammanfattning är inriktad på studier av DPC reparation i däggdjursceller kultur system, betydande bidrag till den nuvarande modellen för DPC reparation har gjorts med hjälp av mikrobiell och cell-fria system som inte diskuteras i detta Manuskriptet.
Kanske är den lättaste strategi som kan vidtas för att få inblick i genetiken av DPC reparation att bedöma respektive känslighet till celldöd hos vildtyp och muterade celler utsätts för agenter som inducerar DPC6,7. Denna strategi är relativt snabb, billig och kräver inte specialistkompetens utöver möjligheten att utföra grundläggande cell kultur tekniker. Som motvikt till dessa fördelar är många begränsningar för detta synsätt bland annat följande. Första mäter analysen direkt inte DNA-reparation. Den arbetshypotes som ligger bakom denna strategi är att inactivating mutationer i gener som kodar för relevanta DNA reparation proteiner leder till en ansamling av DNA skada som utlösare programmerad celldöd. Dock kan, mutationer i gener som kodar för icke-DNA-reparation proteiner i princip, öka (eller minska) cellulär känslighet för xenobiotiska-inducerad celldöd. Det andra agenter som skapar DPC alltid framkalla andra typer av DNA-skador (ett undantag är 5-aza-2′-deoxycytadine, men denna agent också utarmar cellulära methyltransferase nivåer8). Därför är det tänkbart att ökad cellulär överkänslighet mot agenten i fråga kan återspegla defekter i reparation av interstrand antipyridinantikropp eller andra skador. För det tredje, som nämndes ovan, DPC representerar en oerhört heterogen klass består av olika typer av kemiska antipyridinantikropp, inbegriper partner från olika protein. Det är möjligt att medan reparation av en eller flera undertyper av dessa lesioner kan ändras i en viss genetisk bakgrund, inte kan denna skillnad är tillräcklig för att avsevärt ändra cellulära överkänslighet mot döden som induceras av denna agent. Sammanfattningsvis, medan denna strategi utgör en attraktiv utgångspunkt, betona begränsningarna ovan vikten av att fullfölja andra, mer direkta metoder för att studera kinetiken för DPC reparation.
Ett antal relaterade metoder har utvecklats för att uppnå detta mål. Utredarna har exempelvis utvecklat metoder att skilja mellan ‘gratis’ DNA och ‘protein-bound’ DNA9,10,11. Med dessa metoder, är det möjligt att jämföra steady state nivåer av DPC-anrop eller efter exponering för en DPC-producerande agent i olika genetiska bakgrunder. De två strategier som har använts mest innebära separera DPC-innehållande DNA från gratis DNA med hjälp av antingen en nitrocellulosa membran bindande strategi eller KCl/SDS nederbörd12,13. I den tidigare strategin celler lyserat och passerade genom ett filter av nitrocellulosa. Eftersom nitrocellulosa binder proteinet, behåller filtret protein-kopplade DNA, tillåter gratis DNA att passera. I den sistnämnda strategin separeras proteinbundet DNA från gratis DNA bygger på det faktum att SDS binder till protein men inte DNA, och kan utlösas av tillägg av KCl. Protein-kopplade DNA blir följaktligen olösliga medan obundna DNA förblir i lösning. DPC-innehållande DNA kan sedan vara quantitated med radiomärkt tymidin (om celler var ursprungligen metaboliskt märkt) eller genom ett DNA-selektiv fluorescerande färgämne som Hoechst 33258. Dessa metoder är reproducerbara och kräver ett litet antal steg. Men ger de inte information om arten av den kemiska crosslink genom vilket protein är kopplad till DNA. Dessutom är det viktigt att Observera att dessa analyser kan överskatta DPC reparera genom att falskeligen scoring ofullständig reparation, dvsproteolytiska bearbetning till mindre DNA-peptid antipyridinantikropp som inte kanske är lika lätt instängd eller fällning, som ärligt uppsåt DNA reparera.
Komet analyser kan användas för att visualisera DPC bildandet i celler14. I dessa experiment minska förekomsten av DPC DNA migration som kan sedan återföras genom förbehandling med proteinas K. Längden på svansen kan därför användas för att uppskatta DPC bildandet. Men som nämnts ovan, skapa DPC-bilda droger andra typer av DNA-skador som kunde förändra svanslängd. Detta protokoll är också mycket tekniska och kräver expertis och utbildning i confocal imaging.
Masspektrometri kan användas för att studera DPC reparation kinetik efter behandling med crosslinking agenter15,16,17. Dessa experiment behandla celler med DPC-bilda agenter och isolera DPC-anrop via utvinning för biotin capture eller fenol: kloroform (1:1). Masspektrometri kan sedan användas för att identifiera de tvärbundna proteinerna eller kvantifiera mängden DPC bildas över tid. Den stora fördelen med detta tillvägagångssätt är arten av de uppgifter som produceras. Det är möjligt att just katalog typerna av proteiner som blir tvärbundna efter exponering för en xenobiotiska, dock detta protokoll är dyrt, tidskrävande, och begränsas av typ av crosslink som kan upptäckas.
Maizels et al. utvecklat en känslig ‘RADAR’ (snabb inställning till DNA addukt återhämtning) analysen att kvantifiera immunodetection av DNA-protein addukter samt en ELISA-baserade RADAR assay18,19. Dessa analyser är särskilt användbara för svällning DNA-protein intermediärer som övergående bildar i celler och generera prover lämpliga för massa spektroskopi att identifiera nya protein addukter. Denna immunodetection analys bygger på tillgänglighet av antikroppar att fånga den DNA-protein crosslink och därför kanske inte kan upptäcka försämrad DNA-peptid addukter formuläret under reparation. Nyligen, en specifik DPC reparera vägen kopplade till DNA-replikation och en DNA-beroende metalloprotease Spartan upptäcktes i vilken DPC-anrop är proteolyzed till mindre peptider under reparation20,21. Ärftliga mutationer i denna gen är associerade med Ruijs-Aalfs syndrom hos människor, en sjukdom som kännetecknas av genomisk instabilitet, för tidigt åldrande och levercancer22. Möss med genmanipulerade spartanska gen defekter visar liknande fenotyper23.
Värdcellen reaktivering av transkriptionell aktivitet har använts för att studera reparation av definierade lesioner på transfekterade plasmid DNA substrat24,25. I dessa experiment, plasmid som innehåller DPC-anrop (eller andra typer av DNA lesioner) som blockerar transkriptionen av en reporter, såsom luciferas, är transfekterade celler. Luminiscens mätningarna tagna 24-72 h senare sedan är korrelerade med DPC reparation. Men dessa indirekta reparation testmetoder är oförmögna att upptäcka reparation händelser tidigare än 24 h efter transfection och inte kan skilja mellan RNA-polymeras förbikopplingen av delvis reparerade substrat och komplett reparation.
Var och en av metoderna som beskrivs ovan har fördelar och har bidragit till den nuvarande modellen för DPC reparation. Dock SSPEN-qPCR analysen kringgår flera av de begränsningar som är associerade med dessa andra metoder och följaktligen kan ge mer specifik insikt i DPC reparationsmekanismer. Exempelvis kan den SSPEN-qPCR-analysen direkt mäta reparation av platsspecifika DPC på DNA i intakt däggdjursceller. Denna metod är mångsidig och har använts för att erhålla reparation resultat efter transfection i hamster och mänskliga cellinjer. Transfection av Plasmiden kan utföras med lipofection eller elektroporation i odlade däggdjursceller linjer. Det garanterar också att endast reparation av definierade DPC mäts, och inte andra typer av DNA-skada inducerad av de flesta DPC-bilda agenter. Den SSPEN-qPCR är enkelt att utföra, billig och snabb. Resultat som erhållits med hjälp av denna analys har upptäckt reparation händelser så tidigt som 2 h efter transfection. Med den här metoden kan variabler som kan påverka DPC reparation utfall studeras på ett sätt som är känslig och effektiv. Till exempel har rollen av transkription i DPC reparation ännu inte utvärderas noggrant. På grund av flexibiliteten hos SSPEN-qPCR-analys, kan crosslinking platsen för DPC manipuleras för att åtgärda denna fråga. Införandet av en beskärning av replikering till DPC-bärande Plasmiden kan dessutom användas att hantera påverkan av replikering på DPC reparation. Dessutom kan flera antipyridinantikropp skapas på plasmiden att undersöka skillnader i reparation av en enda DPC kontra flera antipyridinantikropp. Det är frågor som skulle vara svår att besvara med hjälp av kromosomala DNA men kan enkelt åtgärdas med Specialföretaget-qPCR-analys. Övergripande, Specialföretaget-qPCR analysen kräver renas, plasmid DNA i mikrogram mängder innehållande en lesion av en känd plats. Addukter förutom DPC kan användas i denna analys, dock lesionen måste kunna blockera förlängning av Taq polymeras.
Metoden SSPEN-qPCR erbjuder många fördelar jämfört med andra tillvägagångssätt genom att undersöka reparation av en homogen befolkning som innehåller en enda, definierade DPC lesion. Det är anmärkningsvärt att förutom kontrollera identiteten hos proteinet och typen av kemisk crosslink används för att ansluta proteinet till DNA, är det möjligt att enkelt manipulera sekvens ramen som DPC lesionen introduceras. Vi har utforskat påverkan på DPC reparation av att införa lesionen på antingen mallen eller kodning strand av en plasmid nedströms av en aktiv promotor locus. Likaså, vi håller på att undersöka påverkan på DPC reparation av replikering med en M13 plasmid som innehåller en SV40 ursprung replikering transfekterade i HEK293T celler. Analysen som beskrivs häri direkt åtgärder DPC reparation, i motsats till andra strategier som värd cell reaktivering att indirekt uppskattningar reparera aktivitet24,25. Systemet är dessutom robust, känslig och kvantitativa. Till skillnad från andra system, som mäter DPC borttagning, denna analys endast upptäcker komplett reparation händelser, dvs, det kräver inte bara att DPC lesionen avlägsnas utan att integriteten för duplex DNA vara helt återställd17. Detta beror på att abasic platser och nicks eller avbrott i phosphodiester ryggraden blockera analysen så effektivt som de ursprungliga DPC lesion29.
Medan rapporten fokuserar på en viss typ av DPC, som skapades av natriumborhydrid svällning enzym reaktion mellanliggande, vi utvecklar för närvarande metoder för att studera reparation av DPC-anrop som involverar andra proteiner och lesioner där protein kopplingen till DNA sker genom nukleosid basen, i stället för ribos position. Använda reduktiv aminering, har vi skapat protein och peptid antipyridinantikropp fäst vid guanin eller cytosin bas av en DNA primer30. Dessa oligonukleotider var renas till homogenitet och används för att generera supercoiled plasmider som innehåller DNA-protein och DNA-peptid antipyridinantikropp. Samtidigt som effektiviteten i dessa reaktioner reduceras något i förhållande till oxoguanine glykosylas crosslink tillvägagångssätt som beskrivs i detalj ovan, de lyckades ändå och tillåta granskning av reparation av dessa substrat i vildtyp och nucleotide excision repair-brist på däggdjursceller linjer. Vi har också använt SSPEN-qPCR analysen för att studera reparation av oxoguanine lesioner och ett syntetiskt ribos-kolesterol konjugat, som visades tidigare repareras via den cellulära nucleotide excision repair maskiner31. Som figur 2 visar grafiskt, reparation av någon lesion att block primer förlängning av Taq polymeras kan, i princip mätas med Specialföretaget-qPCR-analys.
Aktuella modeller av DPC reparation tyder på att större DPC (> 10 kDa) utsätts proteolytiska behandling till mindre peptid lesionen före borttagning32,33,34. Troligaste kandidaterna ansvarar för denna proteolys är proteasom eller en specifik proteashämmare i mänskliga celler som heter spartanska20,21,35,36,37, 38. ytterligare utredningar in i roller av dessa proteaser kan genomföras med Specialföretaget-qPCR-analys. Proteasomhämmare kunde användas för att förbehandla celler före transfection med DPC-innehållande substrat. Alternativt kunde vara transfekterade spartanska knockdown cellinjer med skadade plasmider att belysa dess roll i proteolys av större DPC.
Oavsett vilken metod som används för att skapa crosslink eller DNA lesionen karaktär, är det värt att understryka att metoden SSPEN-qPCR är kritiskt beroende av förmågan att generera betydande mängder homogen DPC-plasmid substrat. Steg som är väsentliga för denna analys inkluderar rening av kovalent, stängd cirkulär plasmid efter primer förlängning för att eliminera någon nicked eller linjär plasmid molekyler. Dessa föroreningar måste elimineras för att säkerställa att eventuella efterföljande DPC reparation observerats inte beror på nick-riktad eller dubbel-strand paus-regisserad reparationsprocesser. Underlåtenhet att erhålla tillräckliga mängder av supercoiled DNA efter primer filändelsen reaktioner kan övervinnas genom att variera förhållandet mellan oligonukleotiden till enkelsträngat DNA. Ett annat viktigt steg för Specialföretaget-qPCR metoden, är crosslinking effektivitet av proteinet till Plasmiden. I denna studie användes en effektiv, enzymatisk reaktion till crosslink oxoguanine glykosylas proteinet till en 8-oxo-guanin lesion. Sub optimal crosslinking kan förbättras genom att variera mängden protein till reaktionen.
Medan resultaten beskrivs i denna rapport åberopade lipofection att införa DPC reparation substrat i mottagarens celler, det finns ingen anledning, en priori, andra transfections metoder inte kunde anställas. Vi har utfört preliminära studier och observerade att elektroporation39 kan också användas. Men det är värt att notera att vår erfarenhet, elektroporation transfection effektivitet minskas jämfört med lipofection och vi fann det nödvändigt att använda transportören DNA (upp till 5 µg) utöver de 1,5 µg av DPC substrat för att få reparera data. Specialföretaget för värdepapperisering-qPCR metoden som beskrivs ovan ger sammantaget ett innovativt sätt att uteslutande undersöka DPC reparation på plasmid DNA och generera nya insikter om DNA skador svaret.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av National Institutes of Health (ES023350). Lisa Chesner stöds av utbildning Grant 5T32HL007741. Vi tackar Natalia Tretyakova (University of Minnesota) och Ashis Basu (University of Connecticut) och medlemmarnas lab för stöd och teknisk rådgivning under de tidiga och mellanliggande stadier av detta arbete.
8-oxoguanine modified oligo | Midland Certified Reagent Company | NA | Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’ |
T4 PNK | NEB | M0201S | |
Single-stranded M13 | NEB | N4040S | |
Taq polymerase | NEB | M0267L | |
ATP, 100mM | Thermo Scientific | R0441 | |
dNTP Mix, 10mM each | Thermo Scientific | R0192 | |
BSA | NEB | B9001S | |
T4 polymerase | NEB | M0203L | |
T4 ligase | NEB | M0202L | |
β-agarase | NEB | M0392S | |
Oxoguanine glycosylase 1 | NEB | M0241S | |
SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | green PCR master mix |
Primer R | UMN Genomic Center | NA | 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’ |
Primer L | UMN Genomic Center | NA | 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’ |
Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-012 | transfection reagent |
BspD1 | NEB | R0557S | |
NEB buffer 2 | NEB | B7002S | |
StepOnePlus Real Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
Chloroform, reagent ACS, spectro grade | ACROS | 40463-5000 |