Spalteåbninger Tape-Peel: En forbedret metode til vagt celle prøveforberedelse
Summary
Denne protokol beskriver en metode til at forberede beriget spalteåbningernes guard celler, der er nyttig for fysiologiske og andre biologiske undersøgelser.
Abstract
Studiet af guard celler er vigtigt, at viden om de specifikke bidrag af denne celletype til den overordnede funktion af planter. Men det er ofte vanskeligt at isolere og dermed at studere dem ofte giver en udfordring.
Denne undersøgelse etablerer en spalteåbningernes vagt celle berigelse metode. Protokollen udnytter Scotch tape for at isolere guard celler og udtrække proteiner fra cellerne. Denne metode forbedrer integritet og udbytte af guard celle under isolation og giver en pålidelig prøve for undersøgelse af celle signalering processer og hvordan de korrelerer til spalteåbningernes bevægelse fænotyper. I denne metode, var plante blade opdelt mellem to dele af båndet og pillet fra hinanden for at fjerne den abaxial side. Denne protokol blev anvendt til Arabidopsis blad væv til at isolere guard celler. Cellerne blev behandlet med fluorescein diacetat (FDA) til at bestemme levedygtighed og abscisic syre (ABA) at vurdere spalteåbninger bevægelse i svar til ABA. Til sidst, denne protokol viser sig nyttigt for at forberede beriget spalteåbningernes guard celler og isolere proteiner. Kvaliteten af celler og proteiner fremstillet her aktiver fysiologiske og andre biologiske undersøgelser.
Introduction
Spalteåbninger spiller en vigtig rolle i den overordnede fysiologi og fitness af planter. Disse lille plante specifikke strukturer er dannet af to specialiserede epidermale celler kendt som vagt celler og findes mest talrigt på abaxial overfladen af bladene. Spalteåbningerne er nødvendige for udvekslingen af gasser mellem anlægget og atmosfæren, samt kontrol af vandtab gennem transpiration. Vagt celler regulere spalteåbninger blænde gennem integration af forskellige eksterne (f.eks., lys, fugtighed, patogen kontakt, kuldioxid niveauer) og indre (e.g., endogene hormoner) stimuli1,2. I de sidste 20 år, er denne celletype blevet en modelsystem for at studere celle signalering processer i planter. Disse celler udgør en lille brøkdel af de samlede cellerne i et blad; for at undersøge deres unikke cellulære, biokemiske og molekylær egenskaber i en enkelt celle måde, det er således nødvendigt at isolere dem fra andre blad celletyper. I fortiden, har vagt celle undersøgelser ofte involveret udarbejdelse af vagt celle protoplasts (GCP)3,4,5. Dette typisk kræver brug af store mængder af cellevæg nedværdigende enzymer og eller mekanisk afbrydelse via blanding og har vist sig at være dyrt og tidskrævende som det generelt tager mange timer til at forberede en GCP prøve, ofte gange med ringe udbytte. Endnu vigtigere, fordi guard celler fungerer som komplet par at regulere spalteåbninger blænde, kan brugen af GCP ses som et kunstigt system til at studere guard celle signalering.
Her, har vi udviklet en metode til at forberede spalteåbninger hvor intakt guard celler er beriget og vedligeholde fysiologiske reaktioner på stimuli. Denne metode var inspireret af en metode, der blev brugt til at isolere mesofyllet celle protoplasts6,7. I vores metode tilberedt spalteåbninger ved hjælp af klare Scotch tape til første adskille fleste mesofyllet celler knyttet til det adaxial lag af blade fra abaxial laget med fortovet og vagt celler. Dette gøres ved at anbringe et stykke tape på hver side af bladet og peeling dem fra hinanden. Celler fra det abaxial lag er tilladt at inddrive under lys i en buffer, spalteåbninger-åbning. Senere fjernes de resterende fortov celler ved hjælp af en lille mængde af cellevæggen nedværdigende enzymer, efterlod guard celle, der er beriget på båndet.
I denne simple metode, spalteåbningernes vagt celler, der er både bæredygtige og lydhør kan hurtigt og være effektivt parat, tager mindre end en time for at få beriget spalteåbningernes guard celler fra 50 peelinger med minimale omkostninger. Metoden her pålægger mindre skade på plantecellerne end tidligere metoder hvor protoplasts tilberedes. Derudover materiale, der indsamles fra denne metode udbytte ønskelig protein beløb. Vigtigst, fordi bladet ikke er udsat for blanding eller langvarige fordøjelsen gange og vagt celler forbliver intakt, resultaterne af undersøgelserne vil nærmere være relevant som en vagt cellens naturlige biologi. Med denne metode kan være korreleret spalteåbningernes bevægelser i realtid med ændringer på det molekylære niveau. Således, den viden opnået fra undersøgelser ved hjælp af denne forberedelse metode ville være vigtigt for en mere omfattende forståelse af guard celle signalering.
Vi brugte planten Arabidopsis thaliana som model. men denne protokol kan anvendes til berigelse af spalteåbningernes guard celler i andre plantearter såsom Brassica napus med små ændringer i fordøjelsestid. Som en proof of concept viste vi, at spalteåbningernes guard celler beriget via denne metode er levedygtig og reagerer på stimuli som vist af fluorescein diacetat (FDA) analyse og undersøgelser udnytter anlægget hormon abscisic syre (ABA), henholdsvis. Derudover har vi vist, at høj kvalitet proteiner kan isoleres fra disse guard celler. Her beskriver vi en detaljeret protokol af denne proces.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vagt celler er et modelsystem til at studere signaltransduktion mekanismer i planter og det er vigtigt at sikre, at forberedelsen af prøver, der indgår i undersøgelsen er den mest hensigtsmæssige til at besvare biologiske spørgsmål. Trods den stigende interesse i vagt celler inden for forskning plantesamfund, der er ingen universel metode om hvordan man forbereder spalteåbningernes guard celler, der ville give både spalteåbningernes bevægelse og fysiologi samt de molekylære forandringer skal undersøges i en s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Daniel Chen fra Digital Video produktion Team af Buchholz High School for hjælp til at redigere videoen. Denne forskning om spalteåbningernes guard celler, proteomics og metabolomics i Chen lab er blevet støttet af tilskud fra os National Science Foundation (0818051, 1158000 og 1412547). Wenwen Kong understøttes af Kina stipendium Rådet. Dr. Qiuying Pang er støttet af Kina stipendium Rådet og National Natural Science Foundation of China (31570396).
Materials
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
Riferimenti
- Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
- Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
- Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).
- Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts. New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).
- Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).
- Wu, F. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich – a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 10 (2009).
- Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, (2015).
- Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Agnew, B., Murray, D., Patton, W. A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents. Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895). Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
