Stoma Tape-Peel: Een verbeterde methode voor de bereiding van de monsters van de Guard cel
Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor te bereiden van verrijkte stomatal guard cellen die nuttig is voor fysiologische en andere biologische studies.
Abstract
De studie van guard cellen is essentieel om de kennis van de specifieke bijdragen van dit celtype aan de algehele functie van planten. Echter is het vaak moeilijk om te isoleren en aldus het bestuderen van hen vaak biedt een uitdaging.
Deze studie stelt een stomatal bewaker cel verrijking methode. Het protocol maakt gebruik van plakband om guard cellen isoleren en haal eiwitten uit de cellen. Deze methode verbetert de integriteit en de opbrengst van guard cel in isolatie en biedt een betrouwbare steekproef voor de studie van cel signalering processen en hoe zij aan stomatal verkeer fenotypen correleren. Bij deze methode, waren de bladeren van de plant opgedeeld tussen de twee gedeelten van de tape en geschild uit elkaar om te verwijderen van de abaxial kant. Dit protocol werd toegepast op Arabidopsis blad weefsel te isoleren guard cellen. De cellen werden behandeld met fluoresceïne DIACETAAT (FDA) om te bepalen van de levensvatbaarheid en abscisic zuur (ABA) te beoordelen van stoma verkeer naar aanleiding van ABA. Tot slot bewijst dit protocol nuttig voor de voorbereiding van verrijkte stomatal guard cellen en isoleren van eiwitten. De kwaliteit van de cellen en eiwitten verkregen hier inschakelen fysiologische en andere biologische studies.
Introduction
Stoma spelen een belangrijke rol in de algemene fysiologie en fitness van planten. Deze kleine plant specifieke structuren worden gevormd door twee gespecialiseerde epidermale cellen bekend als bewaker cellen en meest overvloedig zijn gevonden op het abaxial oppervlak van bladeren. Stoma zijn noodzakelijk voor de uitwisseling van gassen tussen de fabriek en de atmosfeer, evenals de controle van waterverlies door transpiratie. Guard cellen regelen stoma diafragma door de integratie van verschillende externe (bijvoorbeeld, licht, vochtigheid, pathogen contact, kooldioxide niveaus) en interne (bv., endogene hormonen) prikkels1,2. In de afgelopen 20 jaar uitgegroeid tot dit celtype een modelsysteem voor studeren cel signalering processen in planten. Deze cellen vormen een klein deel van het totaal aantal cellen in een blad; om te onderzoeken hun unieke mobiele, biochemische en moleculaire eigenschappen in een eencellige manier, het is dus noodzakelijk om hen te isoleren van andere celtypes van het blad. In het verleden betrokken guard cel studies zijn vaak de voorbereiding van guard cel protoplasten (GCP)3,4,5. Dit meestal vereist het gebruik van grote hoeveelheden van celwand vernederende enzymen en/of mechanische storingen via mengen en heeft bewezen om dure en tijdrovende worden als het over het algemeen vele uren duurt te bereiden een steekproef GCP, vaak tijden met weinig rendement. Wat nog belangrijker is, doordat guard cellen als volledige paren fungeert aan stoma diafragma te regelen, kan het gebruik van GCP worden gezien als een kunstmatige systeem aan het bestuderen van de guard cel signalering.
Hier hebben wij een methode ter voorbereiding van de stoma waarin intact guard cellen zijn verrijkt en onderhouden van fysiologische reacties op prikkels ontwikkeld. Deze methode werd geïnspireerd door een methode die werd gebruikt voor het isoleren van de mesophyl cel protoplasten6,7. In onze werkwijze, zijn stoma bereid duidelijk plakband eerst scheiden de meerderheid van de mesophyl cellen zijn verbonden met de adaxial laag van het blad vanaf de abaxial laag met de bestrating en guard cellen. Dit wordt gedaan door het aanbrengen van een stukje tape aan elke kant van het blad en peeling hen uit elkaar. De cellen uit de abaxial laag zijn toegestaan om te herstellen onder licht in een buffer van de stoma-opening. Later worden de overgebleven cellen van de bestrating verwijderd met behulp van een kleine hoeveelheid celwand vernederende enzymen, guard cel die zijn verrijkt achterlaat op de tape.
In deze eenvoudige methode, stomatal guard-cellen die zowel levensvatbare en responsieve kan snel en efficiënt worden voorbereid houdend van minder dan een uur te verkrijgen van verrijkte stomatal guard cellen van 50 schillen met minimale kosten. De methode hier legt minder schade aan de plantencellen dan eerdere methoden waar protoplasten worden bereid. Bovendien, materiaal dat wordt opgevangen uit deze methode opbrengst wenselijk eiwit bedragen. Vooral omdat het blad niet aan het mengen onderworpen is of langdurige spijsvertering tijden en guard cellen intact blijven, zullen de resultaten van studies nauwer relevant zijn voor die van een natuurlijke guard celbiologie. Met deze methode kunnen stomatal bewegingen in real-time worden gecorreleerd met wijzigingen op het moleculaire niveau. Dus zou de kennis die opgedaan uit studies met behulp van deze methode voorbereiding zijn belangrijk voor een vollediger begrip van guard cel signalering.
We gebruikten de plant Arabidopsis thaliana als een model; Dit protocol kan echter worden toegepast op de verrijking van stomatal guard cellen bij andere plantensoorten zoals Brassica napus met kleine wijzigingen in de tijd van de spijsvertering. Als een bewijs van concept, hebben wij aangetoond dat stomatal guard cellen verrijkt via deze methode levensvatbare en reageren op stimuli, zoals blijkt uit de fluoresceïne DIACETAAT (FDA) assay en studies met behulp van het plantenhormoon abscisic zuur (ABA), respectievelijk. Daarnaast hebben we aangetoond dat eiwitten van hoge kwaliteit geïsoleerd uit deze cellen guard worden kunnen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol van dit proces.
Protocol
Representative Results
Discussion
Guard cellen zijn een modelsysteem voor het bestuderen van signaaltransductie mechanismen in planten en het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de bereiding van de monsters in de studie gebruikt het meest geschikt is om biologische vragen te beantwoorden. Ondanks de toenemende interesse in guard cellen binnen de onderzoekswereld plant, er is geen universele methode op hoe voor te bereiden stomatal guard-cellen die het mogelijk de stomatal beweging en de Fysiologie maken evenals de moleculaire veranderingen worden bestu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Daniel Chen vanaf de digitale Video productie Team van Buchholz High School voor hulp bij het bewerken van de video. Dit onderzoek op stomatal guard cellen, proteomics en metabolomica in het lab Chen heeft gesteund door subsidies van de ons National Science Foundation (0818051, 1158000 en 1412547). Wenwen Kong wordt ondersteund door de Raad van de beurs van China. Dr. Qiuying Pang wordt ondersteund door de China Scholarship Raad en nationale Natural Science Foundation van China (31570396).
Materials
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
Riferimenti
- Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
- Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
- Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).
- Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts. New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).
- Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).
- Wu, F. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich – a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 10 (2009).
- Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, (2015).
- Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Agnew, B., Murray, D., Patton, W. A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents. Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895). Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
