Gli stomi nastro-Peel: Un metodo migliore per la preparazione del campione di cellule di guardia
Summary
Questo protocollo descrive un metodo di preparazione arricchite stomatica cellule di guardia che è utile per gli studi biologici fisiologici e altri.
Abstract
Lo studio delle cellule di guardia è essenziale per la conoscenza dei contributi specifici di questo tipo di cella alla funzione generale delle piante. Tuttavia, è spesso difficile isolare e così loro studio spesso rappresenta una sfida.
Questo studio stabilisce un metodo di arricchimento stomatica delle cellule di guardia. Il protocollo utilizza nastro Scotch per isolare cellule di guardia ed estrarre le proteine dalle cellule. Questo metodo migliora l’integrità e il rendimento della cella di guardia durante l’isolamento e fornisce un campione affidabile per lo studio dei processi di segnalazione delle cellule e come essi correlare ai fenotipi movimento stomatica. In questo metodo, le foglie delle piante erano divise tra i due porzioni di nastro e pelate a pezzi per rimuovere il lato abbagliai. Questo protocollo è stato applicato al tessuto di foglia di Arabidopsis per isolare cellule di guardia. Le cellule sono state trattate con diacetato di fluoresceina (FDA) per determinare la vitalità e l’acido abscissico (ABA) per valutare il movimento di stomi in risposta all’ABA. In conclusione, il presente protocollo si rivela utile per la preparazione di cellule di guardia stomatica arricchite e isolare proteine. La qualità delle cellule e proteine ottenute qui enable fisiologico e altri studi biologici.
Introduction
Gli stomi giocano un ruolo importante nella fisiologia complessiva e fitness delle piante. Queste strutture specifiche di pianta molto piccola sono formate da due cellule epidermiche specializzate, conosciute come cellule di guardia e si trovano più abbondantemente sulla superficie abbagliai delle foglie. Gli stomi sono necessari per lo scambio di gas tra la pianta e l’atmosfera, nonché il controllo della perdita di acqua attraverso la traspirazione. Cellule di guardia regolare apertura stomi attraverso l’integrazione di diversi esterni (ad es., luce, umidità, contatto agente patogeno, livelli di anidride carbonica) e interni (ad es., ormoni endogeni) stimoli1,2. Negli ultimi 20 anni, questo tipo di cella è diventato un sistema modello per studiare i processi negli impianti di segnalazione delle cellule. Queste cellule costituiscono una piccola frazione delle cellule totali in una foglia; così, per studiare il loro cellulare unico, proprietà biochimiche e molecolari in maniera singola cellula, è necessario isolarli dagli altri tipi di cella foglia. In passato, gli studi delle cellule di guardia hanno coinvolto spesso la preparazione di cellule di guardia protoplasti (GCP)3,4,5. Questo in genere richiede l’utilizzo di grandi quantità di enzimi degradanti della parete cellulare e/o rottura meccanica tramite fusione e ha dimostrato di essere costoso e richiede tempo, come in genere occorrono molte ore per preparare un campione GCP, spesso volte con poca resa. Ancora più importante, poiché le cellule di guardia fungono da coppie complete di regolare apertura stomi, l’uso di GCP può essere visto come un sistema artificiale per studiare segnalazione delle cellule di guardia.
Qui, abbiamo sviluppato un metodo per preparare gli stomi in cui cellule intatte di guardia sono arricchite e mantenere risposte fisiologiche agli stimoli. Questo metodo è stato ispirato da un metodo che è stato usato per isolare mesofillo cellula protoplasti6,7. Nel nostro metodo, gli stomi sono preparati utilizzando chiaro nastro Scotch per separare prima la maggioranza delle cellule del mesofillo attaccato allo strato adassiale della foglia dallo strato abbagliai contenente la pavimentazione e le cellule di guardia. Questo viene fatto da un pezzo di nastro per ogni lato della foglia di apposizione e sbucciarle apart. Le cellule dallo strato abbagliai sono ammessi per recuperare sotto la luce in un buffer di stomi-apertura. Successivamente le cellule restanti di pavimentazione vengono rimossi utilizzando una piccola quantità di parete cellulare, enzimi, lasciando dietro di sé delle cellule di guardia che si arricchiscono sul nastro degradativi.
In questo semplice metodo, stomatica cellule di guardia sia valide e reattivo può rapidamente e in modo efficiente preparatevi, prendere meno di un’ora per ottenere cellule di guardia stomatica arricchite da 50 bucce con un costo minimo. Il metodo qui impone meno danni per le cellule della pianta rispetto ai metodi precedenti dove sono preparati i protoplasti. Inoltre, materiali raccolti da questa quantità di proteina auspicabile resa metodo. La cosa più importante, perché la foglia non è sottoposto a fusione o tempi di digestione lunga e cellule di guardia rimangono intatte, i risultati degli studi sarà più strettamente pertinenti a quella di biologia naturale di una cella di guardia. Con questo metodo, stomatici movimenti possono essere correlati in tempo reale con i cambiamenti a livello molecolare. Così, le conoscenze acquisite dagli studi utilizzando questo metodo di preparazione sarebbe importante per una comprensione più completa di segnalazione delle cellule di guardia.
Abbiamo usato la pianta Arabidopsis thaliana come modello; Tuttavia questo protocollo può essere applicato all’arricchimento delle cellule di guardia stomatica in altre specie di piante quali Brassica napus con piccole modifiche nel tempo di digestione. Come un proof of concept, abbiamo dimostrato che cellule di guardia stomatica arricchite tramite questo metodo sono vitali e sensible a reagire agli stimoli come mostrato dalla fluoresceina diacetato (FDA) analisi e studi che utilizzano l’ormone vegetale l’acido abscissico (ABA), rispettivamente. Inoltre, abbiamo dimostrato che le proteine di alta qualità possono essere isolate da queste cellule di guardia. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato di questo processo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellule di guardia sono un sistema modello per studiare i meccanismi di trasduzione del segnale nelle piante ed è importante garantire che la preparazione dei campioni utilizzati nello studio è il più appropriato per rispondere alle domande biologiche. Nonostante il crescente interesse in cellule di guardia all’interno della comunità di ricerca di pianta, non esiste un metodo universale su come preparare stomatica cellule di guardia che permettesse sia il movimento stomatica e fisiologia così come i cambiamenti mole…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Daniel Chen dalla Digital Video produzione Team di Buchholz High School per assistenza nell’editing del video. Questa ricerca su cellule di guardia stomatica, proteomica e metabolomica in laboratorio Chen è stata sostenuta da sovvenzioni dal US National Science Foundation (0818051, 1158000 e 1412547). Wenwen Kong è supportato dal Consiglio di borsa di studio di Cina. Dr. Qiuying Pang è supportato dalla Cina Scholarship Council e la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31570396).
Materials
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
Riferimenti
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