الفأر والإنسان-المستمدة من الثقافة أساسي أحادي الطبقة الظهارية المعدة لدراسة تجديد
Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول لإنشاء واستزراع المستمدة من الإنسان والفأر ثلاثية الأبعاد (3D) المعدة أورجانويدس، والطريقة لنقل أورجانويدس ثلاثي الأبعاد إلى أحادي الطبقة 2-الأبعاد. كما يتم وصف استخدام أحادي الطبقة الظهارية المعدة مقايسة الصفر-الجرح رواية لدراسات التجديد.
Abstract
الدراسات في المختبر لإصلاح الجرح المعدة عادة ما ينطوي على استخدام خطوط خلايا سرطان المعدة في مقايسة الصفر-الجرح انتشار الهاتف الخلوي والهجرة. واحد الحد الحرج من هذه الاختبارات، غير أن على تشكيلة متجانسة من أنواع الهاتف الخلوي. الإصلاح هو عملية معقدة تتطلب التفاعل بين العديد من أنواع الخلايا. ولذلك، لدراسة ثقافة خالية من الأنواع الفرعية الخلوية، هو مصدر قلق يجب التغلب عليها إذا أردنا أن نفهم عملية الإصلاح. نموذج أورجانويد المعدة قد تخفف من هذه المسألة حيث المجموعة غير متجانسة من أنواع الخلايا ويعكس عن كثب ظهارة المعدة أو غيرها الأنسجة الأصلية في فيفو. تظاهر هنا هو الرواية، و في المختبر فحص الصفر-الجرح المستمدة من الإنسان أو نات بالماوس أورجانويدس 3 الأبعاد التي يمكن ثم نقل إلى أحادي الطبقة الظهارية المعدة أما أورجانويدس سليمة أو كتعليق خلية مفردة أورجانويدس. وهدف البروتوكول هو إنشاء مونولاييرس طلائي المعدة المستمدة من أورجانويد التي يمكن استخدامها في نظام رواية الصفر-الجرح مقايسة لدراسة تجديد المعدة.
Introduction
استخدام فحوصات الصفر-الجرح طريقة شائعة لدراسة إصلاح وتجديد1،2،،من34،،من56. يمكن استخدام المنهجية المقترحة للدراسة على وجه التحديد التجدد المعدة واستعمار الملوية البوابية . في الماضي، استخدمت خطوط خلايا سرطان المعدة كوسيلة لدراسة الإصابة جرثومة الملوية البوابية (H. pylori)1،2 وحتى الإصابة بسرطان المعدة مؤخرا كانت خطوط الخلايا مثل الخلايا AGS يفضل1 ،2،،من34. واحد الحد من الثقافات خلية سرطان المعدة هو فشلهم في الخص الخلوية تنوع ظهارة المعدة. في محاولة لمعالجة هذا القصور، أثبت هنا هو إنشاء ونقل الأولية المستمدة الإنسان والفأر 3 الأبعاد فونديك المعدة أورجانويدس (فجوس) لأحادي الطبقة الظهارية المعدة لفحوصات شفاء الجرح استناداً إلى أسلوب تم تعديل الأول ووصف شلايرمان وآخرون. 7 نثبت أن المعدة مونولاييرس طلائي المستمدة من المنفصمة 3D فجوس المعدة أو المستمدة من فجو الخلايا المفردة الاحتفاظ تكوين خلوي استقطاب الذي يمثل تعاونا وثيقا ظهارة المعدة المجراة في. نظراً لأن خطوط خلايا سرطان المعدة لا تثبت تكوين الخلية يعرض هذا الأسلوب، قد البروتوكول الحالي ميزة على أساليب بديلة الصفر-الجرح المقايسة. وقد تم تحسين هذه المنهجية مونولاييرس يمكن المنشأة من أورجانويدس كله أو من تعليق خلية واحدة من أورجانويدس منفصلان ومطلي باستخدام مصفوفة غشاء أو الكولاجين-طلاء بموجبها. والهدف العام من هذا البروتوكول إنشاء أورجانويد اشتقاق ثقافات أحادي الطبقة الظهارية المعدة مقايسة شفاء جرح رواية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تفاصيل البروتوكول الحالي بإنشاء مونولاييرس طلائي المعدة المستمدة من الإنسان والفأرة التي يمكن استخدامها لفحوصات الصفر-الجرح. البروتوكول يعتمد على مفهوم الخلايا الجذعية المقيمين العزل من الإنسان الأولية (أو الماوس) الأنسجة، وهو بروتوكول تعديل نشرت لأول مرة شلايرمان وآخرون<sup class="xref…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل “المعاهد الوطنية للصحة” (نيدك) 5 منح R01 DK083402-07 (YZ).
Materials
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
Riferimenti
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn’s disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
