Mus - og menneske-afledte primære gastrisk epitelial éncellelag kultur for studiet af regenerering
Summary
Her beskriver vi en protokol til oprettelse og dyrkning menneskelige – og mus-afledte 3-dimensionelle (3D) gastrisk organoids, og metoden for overførslen af 3D organoids til en 2-dimensional éncellelag. Brug af gastrisk epitelial éncellelag som en roman scratch-sår assay for regenerering undersøgelser er også beskrevet.
Abstract
In vitro undersøgelser af gastrisk sår reparation indebærer typisk anvendelse af gastrisk kræft cellelinjer i bunden-sår assay cellulære spredning og migration. En kritisk begrænsning af disse analyser, er dog deres homogen sortiment af cellulære typer. Reparation er en kompleks proces, som kræver et samspil mellem flere celletyper. Derfor, for at studere en kultur cellulære undertyper, er en bekymring, der skal overvindes, hvis vi skal forstå reparationsprocessen. Gastrisk organoid model kan afhjælpe dette problem, hvorved en heterogen samling af celletyper nøje afspejler gastrisk epitel eller andre indfødte væv in vivo. Vist her er en roman, in vitro- bunden-sår assay stammer fra menneskelige eller mus 3-dimensional organoids, der kan derefter overføres til en gastrisk epitelial éncellelag, som enten intakt organoids eller som en enkelt cellesuspension af dissocieres organoids. Målet med protokollen er at etablere organoid-afledte gastrisk epitelial encellelag, der kan bruges i en roman scratch-sår assay system for at studere gastrisk regenerering.
Introduction
Brugen af bunden-sår assays er en populær metode til at studere reparation og regeneration1,2,3,4,5,6. Den foreslåede metodologi kan anvendes til specifikt studerer gastrisk regenerering og Helicobacter pylori kolonisering. I fortiden, gastrisk kræft cellelinjer har været brugt som et middel til at studere Helicobacter pylori (H. pylori) infektion1,2 og indtil for nylig gastrisk kræft cellelinjer såsom AGS celler var yndet1 ,2,3,4. En begrænsning af gastrisk kræft cellekulturer er deres undladelse af at sammenfatte den cellulære mangfoldighed af gastrisk epitel. For at forsøge at afhjælpe denne begrænsning viste her er oprettelse og overførsel af primære menneskelige – og mus-afledt 3-dimensionel fundic gastrisk organoids (FGOs) til en gastrisk epitelial éncellelag for sår healing assays baseret på en modificeret metode først beskrevet af Schlaermann al.. 7 vi påvise, gastrisk epitelial encellelag stammer fra forskydes 3D gastrisk FGOs eller FGO-afledte enkelt celler bevarer en polariseret cellulære sammensætning, der nøje repræsenterer det af gastrisk epitel in vivo. Eftersom gastrisk kræft cellelinjer ikke vise celle sammensætning denne teknik viser, har den nuværende protokol en fordel i forhold til alternative scratch-sår assay metoder. Denne metode er blevet optimeret, hvorved encellelag kan være etableret fra hele organoids eller fra en enkelt cellesuspension fra dissocierede organoids og forgyldt, ved hjælp af en basalmembran matrix eller kollagen-belægning. Det overordnede mål med denne protokol er at etablere en organoid afledt gastrisk epitelial éncellelag kulturer for en roman sår healing assay.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuværende protokol detaljer oprettelse af human – og mus-afledte gastrisk epitelial encellelag, der kan bruges til bunden-sår assays. Protokollen afhænger af begrebet bopæl stamceller isoleret fra primære menneskelige (eller mus) væv og er en modificeret protokol først udgivet af Schlaermann al.7. Vi har især optimeret protokol her til at etablere en sammenflydende og polariseret gastrisk epitelial éncellelag udtrykt som store celle slægter, som kan findes inden for gastrisk…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 yde (YZ).
Materials
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
Riferimenti
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn’s disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
