När de genetiska varianter som är associerad med mänskliga sjukdomar börjar bli avslöjade, blir det allt viktigare att utveckla system att snabbt utvärdera den biologiska betydelsen av de identifierade varianterna. Det här protokollet beskriver metoder för att utvärdera mänskliga geners funktion under kvinnliga meios jag använder mus oocyter.
Embryonala aneuploidi är den största genetiska orsaken till infertilitet hos människor. De flesta av dessa händelser uppstår under kvinnliga meios, och om än positivt korrelerade med moderns ålder, ålder ensam är inte alltid förutsägande av risken för att generera ett aneuploid embryo. Därför kanske genvarianter står för felaktiga kromosomsegregering under oogenes. Med tanke på att tillgång till mänskliga äggceller är begränsad för forskningsändamål, utvecklades en rad analyser för att studera mänskliga geners funktion under meios jag använder mus oocyter. Först, budbärar-RNA (mRNA) av genen och Genvariant av intresse är microinjected i profas jag-arresterad mus oocyter. Efter att tid för uttryck, oocyter synkront släpps ut i meiotiska mognad att slutföra meios jag. Genom att tagga mRNA med en sekvens av en fluorescerande reporter, såsom grönt fluorescerande protein (Gfp), kan lokalisering av det mänskliga proteinet bedömas utöver de fenotypiska förändringarna. Till exempel vinst eller förlust av funktion kan undersökas genom att fastställa experimentella förhållanden som utmanar den genprodukten fixar meiotiska fel. Även om detta system är fördelaktiga i att undersöka humant proteinfunktion under oogenes, bör adekvat tolkning av resultaten göras eftersom proteinuttryck inte är på endogena nivåer och, om inte kontrollerat för (dvs knackade ut eller ner) förekommer murina homologs också i systemet.
Barnlöshet är ett tillstånd som drabbar 10-15% av den mänskliga befolkningen av reproduktiv ålder 1, där nästan hälften söka medicinsk behandling 2. Även om etiologin till infertilitet är varierande och i många fall multifaktoriell, är den vanligaste genetiska defekter hos människa embryonala aneuploidi 3. Aneuploidi definieras som avvikelsen (antingen vinst eller förlust) för rätt antal kromosomer i en cell. Fenomen av aneuploidi i mänskliga embryon är vanligt och ökar med moderns ålder 4,5. Fyra randomiserade kontrollerade studier har belyst fördelen att välja endast kromosomalt normala (euploid) embryon för livmoderns överföring eftersom denna strategi resulterade i ökad implantation priser, lägre missfall priser och kortare tid för att uppnå graviditet 6,7,8,9. Därför kan förstå etiologin av mänskliga aneuploidi få stor betydelse i assisterad befruktning.
Även om preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidies är fördelaktigt i barnlöshetsbehandlingar, saknas fortfarande en grundlig förståelse för hur aneuploidies härstammar. Det är allmänt accepterat att det finns en positiv korrelation meiotiska aneuploidies (sitt ursprung under gamete produktion) och moderns ålder, men vissa kvinnor närvarande embryonala aneuploidi priser som avviker från den genomsnittliga skattesatsen för deras given ålder 4. Dessa fall tyder på att ålder ensam inte är alltid förutsägande av risken för att generera ett aneuploid embryo. Andra faktorer kan spela en roll för att öka risken för embryonala aneuploidi, såsom genvarianter.
En viktig aspekt att undersöka en Genvariant till aneuploidi potentiella bidrag under äggcellen meios är att utforma ett system för att snabbt utvärdera meiotiska geners funktion. På grund av etiska restriktioner och begränsad tillgång är det opraktiskt att utföra dessa experiment med mänskliga ägg. Dessa problem kan kringgås med hjälp av musen oocyter och här en rad analyser att bedöma mänskliga geners funktion under meios I är beskrivna. Av microinjecting den budbärar-RNA (mRNA) som kodar för genvarianten sevärdheter, kan localizationen av det mänskliga proteinet i mus ägget visualiseras och används för att bestämma om ektopisk uttryck för vildtyp och muterade mänskliga proteinet resulterar i någon fenotypiska förändringar som kan leda till aneuploidi. Dessa fenotyper inkluderar en ökning i mikrotubuli som fäster det olämpligt att syster Kinetochor och oförmåga att stödja kromosom anpassning vid metafas av meios I. viktigast, detta protokoll kan användas för att undersöka både vinst och förlust av funktion genetiska varianter genom att inrätta särskilda experimentella villkor att utmana viktiga händelser i äggcellen meios som spindel byggnad och kromosom justering 10.
På grund av den snabba och ökande identifieringen av mänskliga genetiska varianter som är associerade med sjukdomen, är det viktigt att system inrättas för att utvärdera deras biologiska betydelse. Förståelse proteinfunktion i mänskliga meios utgör särskilda utmaningar eftersom mänskliga äggceller är dyrbara inte och sällsynta och mänskliga spermier kan bli föremål för genetisk manipulation. Mus oocyter är ett däggdjur modellsystem som är värdefull för att bedöma mänskliga meiotiska gener funk…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av ett forskningsanslag från American Society for Reproductive Medicine och från Charles och Johanna Busch Minnesfond på Rutgers, The State University NJ till K.S. A.L.N. stöddes av ett bidrag från N.I.H. (F31 HD0989597).
0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
Ampicillin | VWR | AA0356 | |
Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
CO2 tank | For incubator | ||
Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
MG132 | Selleckchem | S2619 | |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
N2 tank | for antivibration table | ||
Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
Slide Warmer | any standard model | ||
Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
Stereomicroscope | any standard model | ||
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |