Isolatie van primaire menselijke Decidual cellen van de foetus membranen van Term Placentae
Summary
Dit protocol wordt een methode voor de isolatie van primaire menselijke decidual cellen van de foetale membranen van term placentae die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen (d.w.z. immunocytochemie, stroom cytometry, enz.) verzameld gedemonstreerd die gericht zijn studie de rol van verschillende cel populaties in zwangerschapscomplicaties.
Abstract
De decidua, ook bekend als de zwangere endometrium, is een uitermate belangrijk reproductieve weefsel. Decidual cellen, bestaat voornamelijk uit decidualized stromale cellen en immune cellen, zijn verantwoordelijk voor de afscheiding van hormonale en inflammatoire factoren die kritisch zijn voor succesvolle blastocyst implantatie, ontwikkeling van de placenta en een rol spelen de Inleiding van de arbeid op termijn en vroeggeboorte. Veel zwangerschapscomplicaties kunnen voortvloeien uit de verstoringen van een subtiel evenwicht van andere cel populaties bestaande uit decidua. Wijzigingen in het aandeel van de specifieke decidual celtypes kunnen verstoren deze cruciale processen en verhogen het risico van het ontwikkelen van ernstige complicaties van de zwangerschap, zoals embryo-implantatie mislukking, beperking van de uteriene groei, pre-eclampsie en premature Arbeid. Het protocol hier geschetste toont een kosten en tijd effectieve methode voor de isolatie van primaire menselijke decidual cellen van de foetus membranen van term placentae verzameld. Door het combineren van enzymatische spijsvertering en zachte mechanische verstoring van het decidual weefsel, werd een hoog rendement van decidual cellen verkregen met vrijwel geen chorion besmetting. Belangrijker, geïsoleerde decidual cellen werden gekenmerkt (stromale cellen (55-60%), leukocyten (35%), epitheliale (1%) of cellen van de trofoblast (0.01%)) en onderhouden van hoge levensvatbaarheid (80%), die werd bevestigd door multicolor imaging stroom cytometry assay. Dit protocol is specifiek voor de decidua-parietalis en kan worden aangepast aan de eerste en tweede trimester placentae. Geïsoleerde decidual cellen kunnen worden gebruikt voor een veelheid van experimentele toepassingen gericht op het begrijpen van de rol van de verschillende decidual cel subpopulatie in zwangerschapscomplicaties.
Introduction
Het endometrium, een van de meest actieve volwassen vrouwelijke weefsels, ondergaat dramatische remodelleren elke menstruele cyclus in reactie op de stimulatie van de eierstokken hormonen, (E2) oestrogeen en progesteron (P4). De decidua, ook bekend als de zwangere endometrium, is een uitermate belangrijk reproductieve weefsel dat wordt gevormd door het einde van de postovulatory fase als gevolg van P4-gedreven differentiatie na de E2-dominante proliferatieve fase. Decidual cellen zijn verantwoordelijk voor de afscheiding van hormonale factoren voor succesvolle blastocyst implantatie en voor de ontwikkeling van de utero-placenta interface voor het behoud van de maternale tolerantie voor de foetale allograft.
Decidualization is vereist voor implantatie en latere verbouwing van de decidual spiraal slagaders. Baarmoederslijmvlies stromale cellen ondergaan decidualization, onder de controle van P4 en kamp, tijdens de late luteale fase van de menstruele cyclus1. Dit proces wordt gestart rond de bloedvaten en de spreads in het stroma, suggereert haar rol bij het remodelleren van therapieën en leukocyten mensenhandel van de verordening. Deze cellulaire transformatie wordt gekenmerkt door een circulaire morfologie, toegenomen nucleaire omvang en uitbreiding van het ruw endoplasmatisch reticulum en het Golgi-apparaat2. Decidualized stromale cellen zijn geschikt voor het produceren van paracrine factoren ter ondersteuning van de blastocyst implantatie en gekenmerkt door de afscheiding van talrijke hormonen (d.w.z. prolactine), angiogenic groeifactoren, insuline groeifactor bindende eiwit-1 (IGFBP-1), (PG) prostaglandine E (stimulator van intracellulaire cAMP), cytokines, componenten van de extracellulaire matrix en voedingsstoffen die essentieel zijn voor placenta implantatie en ontwikkeling3,4,5,6 .
De decidual-celpopulatie bestaat niet alleen uit decidualized stromale cellen maar bevat ook grote, zwangerschap-specifieke decidual leukocyten populaties. Decidualization omvat het voorbijgaande gelokaliseerde oedeem en toestroom van Natural killer (NK) cellen, T-cellen, macrofagen en dendritische cellen. De grootste leukocyte subpopulatie is de baarmoeder NK-cellen, bestaande uit ongeveer 50-70% van alle moeders leukocyten infiltreert in de decidua die een bron van cytokinen en angiogenic factoren die kunnen helpen bij het decidualization-proces en verhogen in nummer in de gehele zwangerschap7. Macrofagen, wordt de tweede grootste subpopulatie van immune cellen, worden gevonden rond de innesteling plaats en tijdens zwangerschap8te verhogen. Ze zijn een bron van cytokines en groeifactoren zoals kolonie stimulerende factor (CSF-1)9, Tumornecrosefactor α (TNFα)10 en prostaglandine (PG) E11.
Tijdens de zwangerschap, en vóór de termijn arbeid is de decidua een belangrijke bron van cytokines en chemokines verantwoordelijk voor moeders perifere leukocyten activering en latere migratie in de baarmoeder weefsels tot inleiding van de arbeid. Dierlijke studies is gebleken dat talrijke pro-inflammatoire cytokines omhoog-geregeld in de decidua muis tijdens arbeid, zoals TNF-a, IL-6, IL-12, en IL-1b12. In de menselijke decidua vertonen pro-inflammatoire cytokines IL-1b, IL-6 en IL-8 (grote neutrofiele chemoattractant) hogere expressie tijdens arbeid tegenover niet in arbeid13. Deze cytokines resultaat in een activering en de toevloed van leukocyten uitgescheiden in de decidual weefsels14; een toename van de decidual macrophage en neutrofiele infiltratie in zowel de mens en rat is gezien tijdens termijn arbeid, met decidual infiltratie voorafgaand aan myometrial 4-fold meer, met vermelding van een cascade van activering tussen deze twee-aangrenzende uteriene weefsels 15. Deze infiltreren leukocyten produceren PGs staat activeren synchrone contracties van het myometrium16, matrix metalloproteinasen (MMP) tot membraan scheuren17,18, alsmede pro-inflammatoire cytokines aan het versterken van de uteriene activeringsproces (‘cytokine storm’).
Als gevolg van tal van belangrijke functies van decidual cellen, zoals spelen een cruciale rol in het proces van de innesteling, behoud van moeders-foetale tolerantie in de vroege dracht en deelnemen aan de activering van arbeid op termijn kunnen verschillende pathologieën ontstaan tijdens zwangerschap. Bijvoorbeeld, kan (1) onvruchtbaarheid als gevolg van de steeds terugkerende implantatie falen en terugkerende zwangerschap verlies voortvloeit uit een verzuim van de rijping van het decidual; (2) uteriene groei beperking (IUGR) en pre-eclampsie te wijten aan onjuiste ontwikkeling en dysfunctie van de decidua/placenta of gecompromitteerde vasculaire transformatie op de kruising van de decidual-myometrial; en (3) vroeggeboorte die kan voortvloeien uit de voortijdige decidual activeren.
In het licht van deze belangrijke stoornissen, in combinatie met de ethische en praktische beperkingen van menselijke in vivo studies, tot oprichting van de primaire mens decidual cellijnen is essentieel voor de in vitro analyse met het doel van beter begrip en verbetering van klinische beheer van zwangerschapscomplicaties. Daarom was het doel van ons onderzoek voor de ontwikkeling van een protocol waarmee voor de isolatie van menselijke primaire decidual cellen met een hoge cel opbrengst en levensvatbaarheid van de foetale membranen van term placentae verzameld. Deze huidige protocol duidelijk tijd – en goedkoop cost-effective wordt een methode beschreven voor het isoleren van specifieke subtypen van decidual cellen die worden gebruikt voor een verscheidenheid van in vitro analyses. Karakterisatie van de overvloed en fenotype van decidual subpopulatie op termijn en vergelijking voor de eerste of tweede trimester is van cruciaal belang voor het bepalen van hun rol in de hele menselijke dracht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol beschreven hier toont een kosten en tijd effectieve methode voor het isoleren van de primaire decidual cellen van de foetus membranen van de gehele menselijke term placentae verzameld die is zeer toegankelijk en eenvoudig. Het succes van dit protocol is afhankelijk van twee kritische factoren, (1) de efficiëntie van de decidual afschrapen van de chorion-laag van de foetale membranen en (2) de zorg waarmee de decidual cellen in het gehele protocol worden behandeld. Het is belangrijk dat de chorion weefsel be…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank de donoren, de RCWIH BioBank, en Mount Sinai Hospital/UHN afdeling Obstetrie en Gynaecologie voor de menselijke specimens in deze studie gebruikt. Bedank de leden van de loog lab, met name Dr. Caroline Dunk voor haar hulp bij de ontwikkeling van de methode. Dit werk wordt ondersteund door de Burroughs Welcome Fonds (grant #1013759).
Materials
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope – Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer – Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
Riferimenti
- Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Bell, S. C., D’Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. . Decidualization and relevance to menstruation. , 187-212 (1990).
- Kariya, M. Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).
- Wu, W. -. X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy. Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).
- Bell, S. C. Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua. Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).
- Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. Decidual natural killer cells: key regulators of placental development. Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).
- Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy. Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).
- Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor. Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).
- Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms. Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).
- Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).
- Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).
- Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women. Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biology of Reproduction. 86, 39 (2011).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. Cytokines and infection-induced preterm labour. Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).
- Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. The role of leukocyte traffic and activation in parturition. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).
- Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface. Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).
- Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface. Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).
- Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens. Journal of Visualized experiments. 87, (2014).
- Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue. Journal of Visualized experiments. 112, (2016).
- De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).
- Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).
