Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas
Summary
Dieses Protokoll zeigt eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen deziduale Zellen gesammelt von den fetalen Membranen der Begriff plazentas, die für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. Immunocytochemistry, Durchflusszytometrie, etc.) verwendet werden können mit dem Ziel zur Untersuchung der Rolle von verschiedenen Zell-Populationen in Komplikationen während der Schwangerschaft.
Abstract
Die Decidua, auch bekannt als die schwangere Endometrium, ist ein entscheidender Bedeutung reproduktives Gewebe. Deziduale Zellen, hauptsächlich bestehend aus decidualized Stromazellen und immune Zellen sind verantwortlich für die Sekretion von hormonellen und entzündliche Faktoren sind entscheidend für eine erfolgreiche Blastozyste Implantation, plazentar Entwicklung und spielen eine Rolle bei der Einleitung der Arbeit am Begriff und Frühgeborenen. Viele Komplikationen während der Schwangerschaft können durch Störungen der eine feine Balance der unterschiedlichen Zellpopulationen bestehend aus Dezidua entstehen. Veränderungen im Verhältnis von bestimmten deziduale Zelltypen können diese entscheidenden Prozesse stören und erhöhen das Risiko für schwere Komplikationen der Schwangerschaft, wie Embryo Implantation Versagen, intrauterine Wachstumsretardierung, Präeklampsie und Preterm Arbeit. Die hier beschriebene Protokoll zeigt eine Kosten- und Zeitaufwand die fetalen Membranen der Begriff plazentas wirksame Methode für die Isolierung von primären humanen deziduale Zellen entnommen. Durch die Kombination von enzymatischen Verdauung und sanfte mechanische Störung des deziduale Gewebes, erhielt eine hohe Ausbeute an deziduale Zellen praktisch ohne Chorion-Kontamination. Wichtig ist, zeichneten sich isolierte deziduale Zellen (Stromazellen Zellen (55-60 %), Leukozyten (35 %), epithelialen (1 %) oder Trophoblast (0,01 %) Zellen) und hohe Tragfähigkeit (80 %) die durch mehrfarbige bildgebenden Flow Cytometry Assay bestätigt wurde. Dieses Protokoll ist spezifisch für die Dezidua Parietalis und an ersten und zweiten Trimester plazentas angepasst werden kann. Einmal isoliert, können deziduale Zellen für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen mit dem Ziel zu verstehen, die Rolle der verschiedenen deziduale Zelle Sub-Populationen in Komplikationen während der Schwangerschaft verwendet werden.
Introduction
Das Endometrium, eines der aktivsten erwachsenen weiblichen Gewebe durchläuft dramatischen Umbau jedes Menstruationszyklus in Reaktion auf die Stimulation durch Eierstockhormone, Östrogen (E2) und Progesteron (P4). Die Decidua, auch bekannt als die schwangere Endometrium, ist ein entscheidender Bedeutung reproduktives Gewebe, das durch das Ende der postovulatorischen Phase infolge P4-driven Differenzierung nach der E2-dominante proliferative Phase entsteht. Deziduale Zellen sind verantwortlich für die Sekretion von hormonellen Faktoren für eine erfolgreiche Blastozyste Implantation und für die Entwicklung der Utero-plazentaren Schnittstelle für die Aufrechterhaltung der mütterlichen Toleranz gegenüber der fetale Allograft.
Decidualization ist für die Implantation und die anschließende Umgestaltung der deziduale Spirale Arterien erforderlich. Endometriale Stromazellen Zellen durchlaufen Decidualization, unter der Kontrolle der P4 und Lager, während der späten luteal Phase des Menstruationszyklus1. Dieser Prozess ist rund um die Blutgefäße und breitet sich im ganzen das Stroma, was seine Rolle im Gefäßsystem Umbau und Leukozyten Menschenhandel Verordnung eingeleitet. Diese zellulären Transformation zeichnet sich durch eine kreisförmige Morphologie, erhöhte Kerngröße und Erweiterung des rauen endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat2. Decidualized Stromazellen Zellen sind in der Lage, Parakrine Faktoren unterstützen die Einnistung der Blastozyste und zeichnet sich durch die Ausschüttung zahlreicher Hormone (z. B. Prolaktin), angiogene Wachstumsfaktoren, Insulin Wachstumsfaktor binding Protein-1 (IGFBP-1), Prostaglandin (PG) E (Stimulator der intrazellulären cAMP), Zytokine, Komponenten der extrazellulären Matrix und Nährstoffe essentiell für plazentare Einnistung und Entwicklung3,4,5,6 .
Die deziduale Zellpopulation besteht nicht nur aus decidualized Stromazellen Zellen enthält aber auch große, Schwangerschaft-spezifische deziduale Leukozyten Populationen. Decidualization beinhaltet die transiente lokalisierte Ödeme und Zustrom von natürlichen killer (NK)-Zellen, T-Zellen, Dendritische Zellen und Makrophagen. Die größten Leukozyten Teilgesamtheit ist die uterinen NK-Zellen, bestehend aus ca. 50-70 % aller mütterlichen Leukozyten infiltrieren die Dezidua die eine Quelle von Zytokinen und angiogenen Faktoren, die möglicherweise Hilfe bei der Decidualization-Prozess und Zunahme der Anzahl in der gesamten Schwangerschaft7. Makrophagen, wird die zweitgrößte Subpopulation von Immunzellen, befinden sich rund um den Implantationsort und während der Schwangerschaft8erhöhen. Sie sind eine Quelle von Zytokinen und Wachstum Faktoren wie Kolonie stimulierende Faktor (CSF-1)9, Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF)10 und Prostaglandin (PG) E11.
Während der gesamten Schwangerschaft und vor der Wehentätigkeit ist der Dezidua eine Hauptquelle der Zytokine und Chemokine verantwortlich für mütterliche peripheren Leukozyten-Aktivierung und anschließende Migration in die Gebärmutter Gewebe, Arbeit zu initiieren. Tierstudien zeigten, dass zahlreiche Pro-inflammatorischen Zytokinen bis in die Maus Dezidua geregelt während der wehen, wie TNF-a, IL-6, IL-12 und IL-1 b12. In der menschlichen Dezidua weisen Pro-inflammatorische Zytokine IL-1 b, IL-6 und IL-8 (große Neutrophilen lockstoffgradient) höheren Ausdruck während der Wehen im Vergleich zu nicht im Labor13. Diese Zytokine führen zu einer Aktivierung und Zustrom von Leukozyten in deziduale Gewebe14abgesondert; eine Zunahme der deziduale Makrophagen und Neutrophilen Infiltration in der Mensch und Ratte ist während der Wehentätigkeit, mit deziduale Infiltration vor Myometrial 4-fach größer ist, zeigt eine Kaskade von Aktivierung zwischen diese zwei benachbarte uterine Gewebe gesehen. 15. diese infiltrieren Leukozyten produzieren PGs in der Lage, synchrone Kontraktionen der Gebärmutter16zu aktivieren, Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) Membran initiieren Bruch17,18, sowie Pro-inflammatorischen Zytokinen, die uterine Aktivierung (“Zytokin-Sturm”) zu verstärken.
Während können verschiedene Krankheiten durch viele wichtige Funktionen von deziduale Zellen, wie spielen eine entscheidende Rolle bei der Implantation Aufrechterhaltung mütterlich fötalen Toleranz in der frühen Schwangerschaft und die Teilnahme an der Aktivierung der Arbeit am Begriff auftreten. Schwangerschaft. (1) Unfruchtbarkeit aufgrund von wiederkehrenden Implantation Scheitern und wiederkehrende schwangerschaftverlust kann beispielsweise nach einem Ausfall der deziduale Reifung führen; (2) intrauterine Wachstumsretardierung (IUGR) und Präeklampsie durch unsachgemäße Entwicklungs- und Funktionsstörungen der Dezidua/Plazenta oder kompromittierten Gefäße Umgestaltung an der Kreuzung deziduale Myometrial; sowie (3) Frühgeburt, die von der vorzeitigen deziduale Aktivierung führen kann.
Vor dem Hintergrund dieser wichtigen Erkrankungen, gepaart mit den ethischen und praktischen Einschränkungen des menschlichen in-Vivo -Studien, zur Gründung von primären humanen deziduale Zelllinien ist essentiell für in-vitro- Analyse mit dem Ziel besser zu verstehen und Klinisches Management von Komplikationen während der Schwangerschaft zu verbessern. Daher war das Ziel unserer Forschung, ein Protokoll zu entwickeln, die für die Isolierung von menschlichen primären deziduale Zellen mit hohe Zellausbeute und Lebensfähigkeit, gesammelt von den fetalen Membranen der Begriff plazentas ermöglicht. Das aktuelle Protokoll klar beschreibt ein Zeit und Kosten wirtschaftlicheren Verfahren für bestimmte Subtypen von deziduale isolieren die Zellen für eine Vielzahl von in-vitro- Analysen verwendet werden. Charakterisierung der Fülle und Phänotyp der deziduale Sub-Populationen am Begriff und Vergleich zum ersten oder zweiten Trimester ist entscheidend für ihre Rollen in der gesamten menschlichen Schwangerschaft zu definieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll zeigt eine Kosten- und Zeit effektive Methode zur Isolierung von primärer deziduale Zellen gesammelt aus den fetalen Membranen des ganzen menschlichen Begriff plazentas, sehr zugänglich und unkompliziert ist. Der Erfolg dieses Protokolls ist abhängig von zwei entscheidende Faktoren, (1) die Effizienz der deziduale Schaben aus dem Chorion-Layer die fetalen Membranen und (2) die Pflege, mit der die deziduale Zellen im gesamten Protokoll behandelt werden. Es ist wichtig, dass Chorion Geweb…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten den Spendern, die RCWIH-BioBank und der Mount Sinai Hospital/UHN Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie für die menschliche Exemplare in dieser Studie verwendeten danken. Wir möchten den Mitgliedern des Lauge Labor, insbesondere Dr. Caroline Dunk für ihre Hilfe bei der Methodenentwicklung danken. Diese Arbeit wird von der Burroughs-Willkommen-Fonds (Grant #1013759) unterstützt.
Materials
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope – Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer – Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
Riferimenti
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