Isolering av primære Decidual menneskeceller fra fosterets membraner av begrepet Placentae
Summary
Denne protokollen viser en metode for isolering av primære menneskelige decidual celler fra fosterets membraner av begrepet placentae som kan brukes til en rekke programmer (dvs. immunocytochemistry, flowcytometri, etc.) sikter å studere rollen til ulike celle populasjoner i svangerskapet komplikasjoner.
Abstract
Decidua, også kjent som gravid endometrium, er en kritisk viktig reproduktive vev. Decidual celler, består hovedsakelig av decidualized stromal celler og immunceller, er ansvarlig for utskillelsen av hormonelle og provoserende faktorer som er kritiske for vellykket blastocysten implantasjon, placental utvikling og spille en rolle i den initiering av arbeidskraft på sikt og tidlig. Mange graviditet komplikasjoner kan oppstå fra forstyrrelser av en fin balanse mellom ulike celle populasjoner bestående av decidua. Endringer i andelen av spesifikke decidual celletyper kan forstyrre prosessene avgjørende og øke risikoen for å utvikle alvorlige komplikasjoner i svangerskapet, som fosteret implantasjon svikt, intrauterine vekst begrensning, preeclampsia og tidlig arbeid. Protokollen skissert her viser en kostnadene og tiden effektiv metode for isolering av primære decidual menneskeceller samlet fra fosterets membraner av begrepet placentae. Ved å kombinere enzymatisk fordøyelsen og mild mekanisk avbrudd av decidual vev, ble en høy avkastning decidual celler oppnådd med nesten ingen plasmocitara forurensning. Viktigere, isolerte decidual celler var preget (stromal celler (55-60%), leukocytter (35%), epiteliale (1%) eller trophoblast (0,01%) celler) og vedlikeholdes høy levedyktighet (80%) som ble bekreftet av multicolor tenkelig flyt cytometri analysen. Denne protokollen gjelder for decidua parietalis og kan tilpasses første og andre trimester placentae. Isolerte decidual celler kan brukes til en rekke eksperimentelle programmer å forstå rollen av ulike decidual celle undergrupper i svangerskapet komplikasjoner.
Introduction
Endometrium, en av de mest aktive voksne kvinnelige vev, gjennomgår dramatiske remodeling hver menstruasjonssyklusen svar til stimulering av ovarian hormoner, østrogen (E2) og progesteron (P4). Decidua, også kjent som gravid endometrium, er en kritisk viktig reproduktive vev som dannes ved slutten av den postovulatory fasen som følge av P4-drevet differensiering etter E2 dominerende proliferativ fase. Decidual cellene er ansvarlige for utskillelsen av hormonelle faktorer for vellykket blastocysten implantasjon og utvikling av utero-placental grensesnittet for å opprettholde mødre toleranse føtal allograft.
Decidualization kreves for implantasjon og påfølgende remodeling av decidual spiral arteriene. Endometrial stromal celler gjennomgå decidualization, under kontroll av P4 og cAMP, under sent luteal fase av menstruasjonssyklusen1. Denne prosessen er igangsatt rundt blodkar og sprer seg gjennom det stroma, tyder sin rolle i blodkar remodeling og leukocytter handel regulering. Denne mobilnettet transformasjonen er preget av en sirkulær morfologi, økt kjernefysiske størrelse og utvidelse av rough endoplasmatiske retikulum og Golgi apparatet2. Decidualized stromal cellene kan produsere paracrine faktorer støtte blastocysten implantasjon og preget av utskillelsen av utallige hormoner (i.e. prolaktin), angiogenic vekstfaktorer, insulin vekstfaktor bindende protein-1 (IGFBP-1), prostaglandin (PG) E (stimulator intracellulær Camp), cytokiner, ekstracellulær matrix komponenter og næringsstoffer avgjørende for placental implantation og utvikling3,4,5,6 .
Befolkningen decidual cellen utelukkende består ikke av decidualized stromal celler, men inneholder også store, graviditet-spesifikke decidual leukocytter populasjoner. Decidualization innebærer forbigående lokaliserte oedema og tilstrømningen av naturlige killer (NK) celler, T-celler, dendrittiske celler og makrofager. Den største leukocytter subpopulasjon er livmor NK celler, bestående av ca 50-70% av alle mors leukocytter infiltrert decidua som er en kilde til cytokiner og angiogenic faktorer som kan hjelpe i decidualization prosessen og øke i nummeret gjennom hele svangerskapet7. Makrofager, er den nest største subpopulasjon av immunceller, finnes rundt implantasjon området og øke under graviditet8. De er en kilde til cytokiner og vekst faktorer som koloni stimulerende faktor (CSF-1)9, tumor nekrose faktor î± (TNFα)10 og prostaglandin (PG) E11.
Gjennom hele svangerskapet, og før begrepet arbeidskraft er decidua en stor kilde av cytokiner og chemokines ansvarlig for mors perifere leukocytter aktivisering og påfølgende overføring inn i livmor vev å initiere arbeid. Dyrestudier viste at mange pro-inflammatoriske cytokiner er opp-regulert i musen decidua under arbeid, som TNF-a, IL-6, IL-12, og IL-1b12. I den menneskelige decidua vise pro-inflammatoriske cytokiner IL-1b, IL-6 og IL-8 (store nøytrofile chemoattractant) høyere uttrykk under arbeid ikke i arbeidskraft13. Disse utskilles cytokiner føre en aktivisering og tilstrømningen av leukocytter til decidual vev14; en økning i decidual macrophage og nøytrofile infiltrasjon i både menneskelige og rotten er sett under begrepet arbeid, med decidual infiltrasjon foran myometrial 4-fold større, som indikerer en kaskade av aktivisering mellom denne to tilstøtende livmor vev 15. dette infiltrere leukocytter produsere PGs i stand til å aktivere synkron sammentrekninger av myometrium16, matrise metalloproteinases (MMPs) å starte membran ruptur17,18, samt Pro-inflammatoriske cytokiner å forsterke livmor aktiveringsprosessen (“cytokin storm”).
På grunn av mange viktige funksjoner i decidual celler, som spiller en avgjørende rolle i implantasjon prosessen, opprettholde mødre fosterets toleranse i tidlig svangerskapet og delta i aktiviseringen arbeid på sikt, kan ulike patologi oppstå under graviditet. For eksempel kan (1) ufruktbarhet tilbakevendende implantasjon feil og tilbakevendende graviditet skyldes feil på decidual modning; (2) intrauterine vekst restriksjonskoder (IUGR) og preeclampsia feilaktig utvikling og dysfunksjon av decidua/morkaken eller kompromittert vaskulær transformasjon i decidual myometrial krysset; og (3) tidlig fødsel som skyldes tidlig decidual aktivering.
I lys av disse store lidelser, kombinert med de etiske og praktiske begrensningene av menneskelig i vivo studier, etablere primære menneskelige decidual cellelinjer er avgjørende for i vitro analyse å bedre forståelse og bedre klinisk behandling av svangerskapet komplikasjoner. Målet med vår forskning var derfor å utvikle en protokoll som tillater isolering av menneskelige primære decidual celler med høyt yield og levedyktighet fra fosterets membraner av begrepet placentae. Denne gjeldende protokollen tydelig beskriver en tid – og kostnadseffektive metode for isolering av bestemte undergrupper av decidual celler som brukes til en rekke i vitro analyser. Karakterisering av overflod og fenotypen av decidual undergrupper på sikt og sammenligning med første eller andre trimester er avgjørende å definere sine roller gjennom menneskelige svangerskapet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her viser en kostnadene og tiden effektiv metode for å isolere primære decidual celler samlet fra fosterets membraner av hele human frist placentae som er svært tilgjengelig og grei. Suksessen til denne protokollen er avhengig av to viktige faktorer, (1) effektiviteten av decidual skrape fra plasmocitara laget av fetal membraner og (2) omsorg som decidual cellene behandles gjennom protokollen. Det er viktig at plasmocitara vev forurensning er kontrollert ved å sikre at ingen er tilfeldigvis inkl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke givere, RCWIH BioBank, og Mount Sinai Hospital/UHN Institutt for obstetrikk og gynekologi for de menneskelige prøvene brukt i denne studien. Vi vil gjerne takke medlemmer av lut lab, spesielt Dr. Caroline Dunk hennes hjelp med metodeutvikling. Dette arbeidet er støttet av Burroughs velkommen fondet (grant #1013759).
Materials
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope – Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer – Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
Riferimenti
- Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Bell, S. C., D’Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. . Decidualization and relevance to menstruation. , 187-212 (1990).
- Kariya, M. Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).
- Wu, W. -. X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy. Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).
- Bell, S. C. Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua. Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).
- Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. Decidual natural killer cells: key regulators of placental development. Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).
- Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy. Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).
- Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor. Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).
- Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms. Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).
- Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).
- Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).
- Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women. Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biology of Reproduction. 86, 39 (2011).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. Cytokines and infection-induced preterm labour. Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).
- Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. The role of leukocyte traffic and activation in parturition. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).
- Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface. Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).
- Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface. Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).
- Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens. Journal of Visualized experiments. 87, (2014).
- Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue. Journal of Visualized experiments. 112, (2016).
- De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).
- Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).
