Изоляции первичных клеток человека децидуальной от плода мембраны термин Роль162
Summary
Этот протокол демонстрирует метод для изоляции первичных клеток человека децидуальной, собранных от плода мембраны термин роль162, которые могут быть использованы для различных приложений (т.е. immunocytochemistry, проточной цитометрии и т.д.) направленных изучить роль различных клеточных популяций в осложнений беременности.
Abstract
Европейская, также известный как беременные эндометрия, является критически важной репродуктивных тканей. Децидуальной клеток, в основном состоит из decidualized стромальных клеток и иммунных клеток, ответственных за секрецию гормональные и воспалительных факторов, которые имеют решающее значение для успешного бластоциста имплантации, плацентарной развития и сыграть роль в Начало труда на срок и недоношенных новорожденных. Многие осложнения беременности могут возникнуть от возмущения прекрасный баланс различных клеточных популяций, включающий decidua. Изменения доли типов конкретных децидуальной клеток может нарушить этих важнейших процессов и увеличить риск развития серьезных осложнений беременности, например отказ имплантации эмбриона, Внутриутробное ограничение роста, преэклампсией и преждевременные роды. Протокол, изложенные здесь показывает стоимость и время эффективный метод для изоляции первичных клеток человека децидуальной собранные от плода мембраны термин роль162. Объединив ферментативного пищеварения и нежный механическое нарушение децидуальной ткани, высокая доходность децидуальной клеток был получен с практически без загрязнения хориона. Главное, характеризовались изолированных децидуальной клеток (стромальные клетки (55-60%), лейкоциты (35%), эпителиальных (1%) или клеток трофобласта (0,01%)) и поддерживается высокой жизнеспособности (80%), который был подтвержден многоцветной визуализации потока цитометрии пробирного. Этот протокол для decidua parietalis и может быть адаптирована к роль162 первого и второго триместра. После того, как изолированные, децидуальной клетки могут использоваться для множества экспериментальных приложений, стремясь понять роль различных децидуальной клеток субпопуляциях в осложнений беременности.
Introduction
Эндометрия, один из самых активных взрослых женщин тканей, претерпевает драматические ремоделирования каждого менструального цикла в ответ на стимуляцию яичников гормоны, эстрогены (E2) и прогестерона (P4). Европейская, также известный как беременные эндометрия, является критически важной репродуктивных ткани, которая сформирована к концу этапа postovulatory результате P4-driven дифференциация после E2-доминантный Пролиферативная фаза. Децидуальной клетки отвечают за секрецию гормональных факторов для успешного бластоциста имплантации и развития маточно плацентарный интерфейса для поддержания материнской толерантности к плода аллотрансплантатом.
Decidualization является обязательным для имплантации и последующей реконструкции децидуальной спиральных артерий. Эндометрия стромальные клетки проходят decidualization, под контролем P4 и лагерь, в конце лютеиновой фазы менструального цикла1. Этот процесс инициируется вокруг кровеносных сосудов и распространяется по всему стромы, предлагая свою роль в реконструкции сосудистую и лейкоцитов, регулирование оборота. Этот сотовый трансформации характеризуется круговой морфологии, увеличение размера ядерных и расширение грубый эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи2. Decidualized стромальные клетки способны производить паракринными факторов поддержки имплантация бластоцисты и характеризуется секрецию многочисленных гормонов (то есть пролактина), ангиогенных факторов роста, инсулин фактор роста привязки белка-1 (IGFBP-1), простагландины (PG) E (стимулятором внутриклеточных лагеря), цитокины, компоненты внеклеточного матрикса и питательные вещества, необходимые для плацентарного имплантации и развития3,4,5,6 .
Популяции децидуальной клеток не состоит исключительно из decidualized стромальные клетки, но также содержит большой, специфичные для беременности децидуальной лейкоцита населения. Decidualization включает в себя временные локализованные отеки и приток природного убийца (НК) клетки, Т-клеток, дендритные клетки и макрофаги. Самая большая субпопуляция лейкоцитов является матки НК-клеток, состоящий из примерно 50-70% всех матерей лейкоцитов, проникнув decidua, которые являются источником цитокинов и ангиогенных факторов, которые могут помочь в процессе decidualization и увеличение номер на протяжении беременности7. Макрофаги, будучи вторым по величине субпопуляция иммунных клеток, находятся вокруг места имплантации и увеличить во время беременности8. Они являются источником цитокинов и роста такие факторы, как колонии стимулирующий фактор (РСУ-1)9, фактора некроза опухоли альфа (TNFα)10 и простагландина (PG) E11.
Во время беременности и до срока родов Европейская является основным источником цитокинов и chemokines ответственность за материнской лейкоцитов периферической активации и последующей миграции в маточных тканей начать труда. Исследования на животных показали, что многочисленные провоспалительных цитокинов вверх регулируются decidua мыши во время родов, такие как ФНО a, IL-6, Ил-12 и Ил 1b12. В человеческой decidua провоспалительных цитокинов ИЛ 1b, IL-6 и IL-8 (основных нейтрофилов хемотаксического) экспонат выше выражение во время родов, по сравнению с не в труд13. Эти секретным cytokines результат активации и приток лейкоцитов в децидуальной ткани14; увеличение децидуальной макрофагов и нейтрофилов инфильтрации в как людские, так и крыса рассматривается во время срока родов, децидуальной инфильтрации предшествующих миометрия, 4 раза больше, указывающее каскад активации между этой двух прилегающих тканей матки 15. Эти проникновения лейкоциты производят PGs способны активации синхронных сокращения миометрия16, матрицы металлопротеиназ (равенству) инициировать мембраны разрыв17,18, а также провоспалительных цитокинов усилить процесс активации матки («цитокинов шторм»).
Из-за многих важных функций децидуальной клеток, например, играет решающую роль в процессе имплантации, поддержание матери и плода терпимости в начале беременности и участвует в активации труда на срок различные патологии могут возникнуть во время беременности. Например (1) бесплодия из-за периодических имплантации неудачи и привычным невынашиванием может быть результатом сбоя децидуальной созревания; (2) Внутриутробное ограничение роста (IUGR) и преэклампсии из-за неправильного развития и дисфункции decidua/плаценты или скомпрометированных сосудистой преобразования на стыке децидуальной миометрия; а также (3) преждевременных родов, которая может быть результатом преждевременного децидуальной активации.
С учетом этих серьезных расстройств, в сочетании с этических и практических ограничениях человека в vivo исследований, создания линий первичной децидуальной клеток человека имеет важное значение для анализа в пробирке с целью лучшего понимания и Улучшение клинической управления осложнений беременности. Таким образом целью нашего исследования было разработать протокол, который позволяет для изоляции первичных децидуальной клеток человека с высоким клетки урожайность и жизнеспособности, собранных от плода мембраны термин роль162. Этот текущий протокол четко описывает время и экономичным метод для изоляции из конкретных подтипы децидуальной клетки которые использоваться для различных анализов в пробирке . Характеристика изобилия и фенотип децидуальной субпопуляциях в срок и сравнение на первом или втором триместре имеет решающее значение для определения их роли на протяжении беременности человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанные здесь демонстрирует стоимости и времени, эффективный метод для изоляции первичных децидуальной клетки собранные от плода мембраны всей человеческой термин роль162, который является очень доступным и простым. Успех этого протокола зависит от двух важнейших факторов…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить доноров, RCWIH биобанке и Маунт-Синай/UHN Кафедра акушерства и гинекологии для человека образцы, используемые в данном исследовании. Мы хотели бы поблагодарить членов в лаборатории щелок, особенно д-р Каролин замочить за ее помощь в разработке метода. Эта работа поддерживается Фондом Добро Берроуз (Грант #1013759).
Materials
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope – Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer – Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
Riferimenti
- Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Bell, S. C., D’Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. . Decidualization and relevance to menstruation. , 187-212 (1990).
- Kariya, M. Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).
- Wu, W. -. X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy. Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).
- Bell, S. C. Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua. Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).
- Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. Decidual natural killer cells: key regulators of placental development. Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).
- Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy. Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).
- Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor. Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).
- Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms. Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).
- Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).
- Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).
- Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women. Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biology of Reproduction. 86, 39 (2011).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. Cytokines and infection-induced preterm labour. Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).
- Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. The role of leukocyte traffic and activation in parturition. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).
- Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface. Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).
- Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface. Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).
- Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens. Journal of Visualized experiments. 87, (2014).
- Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue. Journal of Visualized experiments. 112, (2016).
- De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).
- Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).
