Этот протокол демонстрирует метод для изоляции первичных клеток человека децидуальной, собранных от плода мембраны термин роль162, которые могут быть использованы для различных приложений (т.е. immunocytochemistry, проточной цитометрии и т.д.) направленных изучить роль различных клеточных популяций в осложнений беременности.
Европейская, также известный как беременные эндометрия, является критически важной репродуктивных тканей. Децидуальной клеток, в основном состоит из decidualized стромальных клеток и иммунных клеток, ответственных за секрецию гормональные и воспалительных факторов, которые имеют решающее значение для успешного бластоциста имплантации, плацентарной развития и сыграть роль в Начало труда на срок и недоношенных новорожденных. Многие осложнения беременности могут возникнуть от возмущения прекрасный баланс различных клеточных популяций, включающий decidua. Изменения доли типов конкретных децидуальной клеток может нарушить этих важнейших процессов и увеличить риск развития серьезных осложнений беременности, например отказ имплантации эмбриона, Внутриутробное ограничение роста, преэклампсией и преждевременные роды. Протокол, изложенные здесь показывает стоимость и время эффективный метод для изоляции первичных клеток человека децидуальной собранные от плода мембраны термин роль162. Объединив ферментативного пищеварения и нежный механическое нарушение децидуальной ткани, высокая доходность децидуальной клеток был получен с практически без загрязнения хориона. Главное, характеризовались изолированных децидуальной клеток (стромальные клетки (55-60%), лейкоциты (35%), эпителиальных (1%) или клеток трофобласта (0,01%)) и поддерживается высокой жизнеспособности (80%), который был подтвержден многоцветной визуализации потока цитометрии пробирного. Этот протокол для decidua parietalis и может быть адаптирована к роль162 первого и второго триместра. После того, как изолированные, децидуальной клетки могут использоваться для множества экспериментальных приложений, стремясь понять роль различных децидуальной клеток субпопуляциях в осложнений беременности.
Эндометрия, один из самых активных взрослых женщин тканей, претерпевает драматические ремоделирования каждого менструального цикла в ответ на стимуляцию яичников гормоны, эстрогены (E2) и прогестерона (P4). Европейская, также известный как беременные эндометрия, является критически важной репродуктивных ткани, которая сформирована к концу этапа postovulatory результате P4-driven дифференциация после E2-доминантный Пролиферативная фаза. Децидуальной клетки отвечают за секрецию гормональных факторов для успешного бластоциста имплантации и развития маточно плацентарный интерфейса для поддержания материнской толерантности к плода аллотрансплантатом.
Decidualization является обязательным для имплантации и последующей реконструкции децидуальной спиральных артерий. Эндометрия стромальные клетки проходят decidualization, под контролем P4 и лагерь, в конце лютеиновой фазы менструального цикла1. Этот процесс инициируется вокруг кровеносных сосудов и распространяется по всему стромы, предлагая свою роль в реконструкции сосудистую и лейкоцитов, регулирование оборота. Этот сотовый трансформации характеризуется круговой морфологии, увеличение размера ядерных и расширение грубый эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи2. Decidualized стромальные клетки способны производить паракринными факторов поддержки имплантация бластоцисты и характеризуется секрецию многочисленных гормонов (то есть пролактина), ангиогенных факторов роста, инсулин фактор роста привязки белка-1 (IGFBP-1), простагландины (PG) E (стимулятором внутриклеточных лагеря), цитокины, компоненты внеклеточного матрикса и питательные вещества, необходимые для плацентарного имплантации и развития3,4,5,6 .
Популяции децидуальной клеток не состоит исключительно из decidualized стромальные клетки, но также содержит большой, специфичные для беременности децидуальной лейкоцита населения. Decidualization включает в себя временные локализованные отеки и приток природного убийца (НК) клетки, Т-клеток, дендритные клетки и макрофаги. Самая большая субпопуляция лейкоцитов является матки НК-клеток, состоящий из примерно 50-70% всех матерей лейкоцитов, проникнув decidua, которые являются источником цитокинов и ангиогенных факторов, которые могут помочь в процессе decidualization и увеличение номер на протяжении беременности7. Макрофаги, будучи вторым по величине субпопуляция иммунных клеток, находятся вокруг места имплантации и увеличить во время беременности8. Они являются источником цитокинов и роста такие факторы, как колонии стимулирующий фактор (РСУ-1)9, фактора некроза опухоли альфа (TNFα)10 и простагландина (PG) E11.
Во время беременности и до срока родов Европейская является основным источником цитокинов и chemokines ответственность за материнской лейкоцитов периферической активации и последующей миграции в маточных тканей начать труда. Исследования на животных показали, что многочисленные провоспалительных цитокинов вверх регулируются decidua мыши во время родов, такие как ФНО a, IL-6, Ил-12 и Ил 1b12. В человеческой decidua провоспалительных цитокинов ИЛ 1b, IL-6 и IL-8 (основных нейтрофилов хемотаксического) экспонат выше выражение во время родов, по сравнению с не в труд13. Эти секретным cytokines результат активации и приток лейкоцитов в децидуальной ткани14; увеличение децидуальной макрофагов и нейтрофилов инфильтрации в как людские, так и крыса рассматривается во время срока родов, децидуальной инфильтрации предшествующих миометрия, 4 раза больше, указывающее каскад активации между этой двух прилегающих тканей матки 15. Эти проникновения лейкоциты производят PGs способны активации синхронных сокращения миометрия16, матрицы металлопротеиназ (равенству) инициировать мембраны разрыв17,18, а также провоспалительных цитокинов усилить процесс активации матки («цитокинов шторм»).
Из-за многих важных функций децидуальной клеток, например, играет решающую роль в процессе имплантации, поддержание матери и плода терпимости в начале беременности и участвует в активации труда на срок различные патологии могут возникнуть во время беременности. Например (1) бесплодия из-за периодических имплантации неудачи и привычным невынашиванием может быть результатом сбоя децидуальной созревания; (2) Внутриутробное ограничение роста (IUGR) и преэклампсии из-за неправильного развития и дисфункции decidua/плаценты или скомпрометированных сосудистой преобразования на стыке децидуальной миометрия; а также (3) преждевременных родов, которая может быть результатом преждевременного децидуальной активации.
С учетом этих серьезных расстройств, в сочетании с этических и практических ограничениях человека в vivo исследований, создания линий первичной децидуальной клеток человека имеет важное значение для анализа в пробирке с целью лучшего понимания и Улучшение клинической управления осложнений беременности. Таким образом целью нашего исследования было разработать протокол, который позволяет для изоляции первичных децидуальной клеток человека с высоким клетки урожайность и жизнеспособности, собранных от плода мембраны термин роль162. Этот текущий протокол четко описывает время и экономичным метод для изоляции из конкретных подтипы децидуальной клетки которые использоваться для различных анализов в пробирке . Характеристика изобилия и фенотип децидуальной субпопуляциях в срок и сравнение на первом или втором триместре имеет решающее значение для определения их роли на протяжении беременности человека.
Протокол, описанные здесь демонстрирует стоимости и времени, эффективный метод для изоляции первичных децидуальной клетки собранные от плода мембраны всей человеческой термин роль162, который является очень доступным и простым. Успех этого протокола зависит от двух важнейших факторов…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить доноров, RCWIH биобанке и Маунт-Синай/UHN Кафедра акушерства и гинекологии для человека образцы, используемые в данном исследовании. Мы хотели бы поблагодарить членов в лаборатории щелок, особенно д-р Каролин замочить за ее помощь в разработке метода. Эта работа поддерживается Фондом Добро Берроуз (Грант #1013759).
Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
DNase powder | Roche | 10104159001 | |
Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Spinning disc confocal microscope – Leica DMI 6000B | Leica | ||
Imaging Flow cytometer – Image Stream MK2 | Amnis | ||
IDEA software | Millipore Sigma | ||
APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |