Eksperimentell protokoll for bruke Drosophila som en virvelløse modellsystem for toksisitet Testing i laboratoriet

Summary

I dette papiret gir vi en detaljert protokoll for å utsette arter i slekten Drosophila til forurensning med mål å studere virkningen av eksponering på en rekke fenotypiske utganger på ulike utviklingsstadier og mer enn én generasjon.

Abstract

Emergent egenskaper og eksterne faktorer (populasjon-nivå og økosystem-nivå interaksjoner, spesielt) spille viktige roller i formidling økologisk viktige endepunkter, men de anses sjelden i toksikologiske studier. D. melanogaster fremstår som en toksikologi modell for opptreden, nevrologiske og genetisk virkningene av giftstoffer, for å nevne noen. Enda viktigere, kan arter i slekten Drosophila benyttes som et modellsystem for rammeverk tilnærming å innlemme emergent egenskaper og svare økologisk relevante spørsmål i toksikologi forskning. Målet med denne utredningen er å gi en protokoll for å utsette arter i slekten Drosophila til miljøgifter som skal brukes som et modellsystem for en rekke fenotypiske utganger og økologisk relevante spørsmål. Mer spesifikt, kan denne protokollen brukes til 1) koble flere biologiske nivåer av organisasjonen og forstå virkningen av giftstoffer på både enkelt – og befolkningen-nivå fitness; 2) test virkningen av giftstoffer på ulike stadier av utviklingsmessige eksponering; 3) test multigenerational og evolusjonære implikasjoner av; og 4) teste flere forurensninger og stressors samtidig.

Introduction

Hvert år er ca 1000 nye kjemikalier innført av kjemisk industri^1,2; Imidlertid er miljøvirkningene av bare en liten prosentandel av disse kjemikaliene testet før distribusjon^2,3. Selv om store katastrofer er uvanlig, sublethal og kronisk eksponering til et stort utvalg av stoffer er utbredt i både mennesker og dyr^4,5. Historiske fokus økotoksikologi og miljømessige toksikologi var å teste dødelighet, enkelt kjemisk eksponering, akutt eksponering og fysiologiske effekter av eksponering, som en måte å måle virkningen av miljøgifter på overlevelse^{6, 7 , 8 , 9 , 10}. selv om det er en dreining mot etiske og ikke-invasive metoder å dyreforsøk, dagens tilnærminger er begrensende rolle som utvikling, emergent egenskaper og eksterne faktorer (for eksempel populasjon-nivå og økosystem-nivå interaksjoner) spille i formidling økologisk viktige endepunktene⁸. Derfor er det behov for metoder som inneholder en mer holistisk tilnærming uten å ofre dyr og/eller virveldyr i laboratoriet.

Virvelløse modellsystemer, for eksempel Drosophila melanogaster, er et attraktivt alternativ til møte behovet for en mer helhetlig tilnærming til toksisitet testing. D. melanogaster, ble opprinnelig utviklet som en virvelløse modellsystem for menneske-relaterte genetisk forskning om århundre siden¹¹. D. melanogaster fremtredende brukes nå som virveldyr modell alternativ for flere grunner: 1) bevaring av gener og veier mellom D. melanogaster og mennesker; 2) kort generasjonstid i forhold til vertebrate modeller; 3) rimelig pris for vedlikehold; 4) lette generere store utvalgene; og 5) mengde fenotypiske og økologisk-relevante endepunktene tilgjengelig for testing^{11,12,13,14,15,16,17} .

Flere laboratorier^{11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25} nå bruker D. melanogaster som virveldyr modell alternativ for toksisitet tester for å forstå konsekvensene av forurensning på mennesker. Lokale arter av Drosophila kan benyttes, også, som toksisitet modeller for dyr og mennesker svare økologisk-, behaviorally-, og evolusjonært relevante spørsmål på flere biologiske nivåer av organisasjonen. Med arter i slekten Drosophila som modell, er flere målbare endepunktene mulig^{11,15,16,18,19,20 ,},^21,,^22,,^23,,^24,,²⁵. In addition, bruker Drosophila modellen, toxicologists kan: 1) etisk koble effekter på flere biologiske nivåer av organisasjonen; 2) innlemme rollen emergent faktorer og utvikling; 3) studere økologisk viktige sluttpunkt (i tillegg til medisinsk viktige endepunktene); 4) teste flere stressfaktorer samtidig; 5) og test langsiktige multigenerational (f.eks evolusjonære og transgenerational) virkningene av stressfaktorer. Derfor gjør bruker Drosophila som et modellsystem en rekke tilnærminger, ikke begrenset å studere mekanistisk tilnærminger med innavlet stammer av D. melanogaster i laboratoriet.

I dette papiret presentere vi metoder for oppdrett og samle Drosophila å svare ulike toksikologiske spørsmål. Mer spesifikt, beskriver vi metodikken for 1) oppdrett Drosophila medium laced med én eller flere stoffer; 2) samle Drosophila gjennom utvikling (f.eks vandrende tredje-skikkelsen larver, pupal tilfeller, nylig-eclosed voksne og eldre voksne); og 3) oppdrett Drosophila i forurensede medium å test intergenerational samt transgenerational overføring og evolusjonære konsekvensene av langvarig toxicant eksponering. Med denne protokollen, tidligere forfattere^{18,19,20,21,22,23,24}har^,25 rapportert forskjellige fysiologiske, genetisk og behavioral virkninger av utviklingsmessige bly (Pb^{2 +}) eksponering. Denne protokollen kan toxicologists bruke en mer helhetlig toksikologiske tilnærming som er nødvendig for å forstå hvordan stoffer er risikofaktorer for både mennesker og dyr i et stadig mer forurenset miljø.

Protocol

Følgende-protokollen er en eksperimentell brukt til bakre arter i Drosophila slekten på forurenset medium når oralt inntak av en gift er aktuelle; andre former for eksponering er mulig å bruke Drosophila modellen11,15,16,26. Metodene som er beskrevet i denne protokollen har tidligere blitt beskrevet av Hirsch et al. 19 og Peterson et al…

Representative Results

Av muntlig utsette Drosophila for en contaminant(s) gjennom utvikling, kan diverse toksikologiske spørsmål testes ved å utsette Drosophila på ulike nivåer av biologisk organisasjon. Denne delen presenterer representant resultatene bruker denne protokollen i tidligere publiserte artikler23,24. Spesielt ble denne protokollen tidligere brukt til å vurdere akkumulering, eliminering og lagring av bly (Pb) til sa…

Discussion

Drosophila melanogaster har blitt etablert som en kraftig modell for en rekke biologiske prosesser på grunn av omfattende bevaring av gener og veier mellom D. melanogaster og mennesker^13,14. Av samme grunn at det er en kraftig modell for medisinsk vitenskap har Drosophila framstått som en passende modell-system for å studere virkningen av menneskeskapt forurensning på en rekke toksikologiske endepunktene. Flere laboratorier bruker v…

Materials

Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24	Carolina Biological	173204
Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit	Genessee Scientific	32-116SB	Used to store flies
Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials	Genessee Scientific	49-102	Used to store flies
Cardboard trays, trays only, narrow	Genessee Scientific	32-124	Used to organize populations of flies
Cardboard trays, dividers only, narrow	Genessee Scientific	32-126	Used to organize populations of flies
Thermo Scientific Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure	Fischer Scientific	03-312D	Useful for storage of contaminants
Thermo Scientific Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles	Fischer Scientific	03-409-17C	Useful for storage of contaminants
Eppendorf Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser	Fischer Scientific	14-287-150	Used to prepare medium
Combitips Advanced Pipetter Tips – Standard, Eppendorf Quality Tips	Fischer Scientific	13-683-708	Used to prepare medium
Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm)	Genessee Scientific	59-114	Used to anesthetize flies
Flystuff foot valve	Genessee Scientific	59-121	Used to anesthetize flies
Tubing, green (1 continguous foot/unit)	Genessee Scientific	59-124G	Used to anesthetize flies
Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle	VWR	97064-130	Used to make a morgue
Glass Erlenmeyer Flask Set – 3 Sizes – 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2	Walmart	Not applicable	Used to make a morgue
BGSET5 Glass Beaker Set Of 5	Walmart
Inbred or wildtype line of Drosophila	Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University		https://bdsc.indiana.edu
Wild popultions of Drosophila	UC San Diego Drosophila Stock Center		https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php