दैहिक SCs की उपलब्धता अपक्षयी दवा, रोग मॉडलिंग के लिए महत्वपूर्ण है और अनुसूचित जाति के गुणों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए । यहाँ हम फिर से प्रोग्राम करने के लिए प्रयोगात्मक रणनीतियों वर्तमान, इन विट्रो में, एकल transcriptional सह उत्प्रेरक याप के क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा उनके संगत विस्तार योग्य ऊतक-विशिष्ट स्टेम/जनक कोशिकाओं में विभेदित वयस्क कोशिकाओं.
यहाँ हम प्राथमिक विभेदित कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल मौजूद है और उन्हें प्रतिलेखन कारक याप की क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा एक ही वंश के स्टेम/जनक कोशिकाओं (SCs) में बदल जाते हैं । इस पद्धति के साथ, माउस स्तन ग्रंथि के चमकदार विभेदित (LD) कोशिकाओं को कोशिकाओं है कि स्तन SCs. याप के आणविक और कार्यात्मक गुणों का प्रदर्शन भी अग्नाशय वाहिनी में पूरी तरह से विभेदित अग्नाशय exocrine कोशिकाओं बदल जाता है में बदल रहे है जैसे progenitors । इसी तरह, अंतर्जात करने के लिए, प्राकृतिक SCs, याप प्रेरित स्टेम की तरह कोशिकाओं (“ySCs”) अंत में organoid संस्कृतियों के रूप में लंबे समय तक विस्तारित किया जा सकता है इन विट्रो, आगे की जरूरत के बिना अस्थानिक याप/TAZ, के रूप में ySCs एक heritable स्व के साथ संपंन कर रहे है अनुसूचित जाति की तरह राज्य
reprogramming प्रक्रिया यहां प्रस्तुत की संभावना उत्पंन करने के लिए प्रदान करता है और इन विट्रो विभिंन ऊतक जनक कोशिकाओं से शुरू स्रोतों की कोशिकाओं में विस्तार । दैहिक कोशिकाओं के सीधा विस्तार पूर्व vivo अपक्षयी दवा के लिए निहितार्थ है, ट्यूमर दीक्षा के तंत्र को समझने के लिए और, सामान्य में और अधिक, सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए.
ऊतक-विशिष्ट दैहिक स्टेम सेल (SCs) ऊतक नवीकरण और चोट के बाद की मरंमत के लिए महत्वपूर्ण हैं । संभावना आसानी से अलग और सीमित रूप से विस्तार पूर्व vivo दैहिक SCs संभावित अपक्षयी उपचारों के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा है, साथ ही साथ बुनियादी अनुसंधान और रोग मॉडलिंग में अनुसूचित जाति के अनुप्रयोगों के लिए का प्रतिनिधित्व करता है । इस दिशा में प्रगति तथापि, विभिंन उपकला अंगों की अनुसूचित जाति राज्य पर कब्जा करने की कठिनाई द्वारा सीमित किया गया है इन विट्रो। दरअसल, कई वयस्क ऊतकों निवासी SCs में मौजूद नहीं हो सकता है, या आसानी से उपलब्ध नहीं हो, या उनकी संख्या और अपक्षयी क्षमता उंर बढ़ने या रोग की स्थिति से घिस सकता है । २०१६ में, हम एक एकल transcriptional coactivator की अभिव्यक्ति है कि रिपोर्टिंग द्वारा इस अंतर को भरने के लिए शुरू कर दिया, याप (हां जुड़े प्रोटीन) या उसके निकट संबंधित प्रोटीन TAZ (एक transcriptional आकृति के साथ PDZ उत्प्रेरक), टर्मिनली विभेदित कोशिकाओं में कुशलतापूर्वक कार्यात्मक, विस्तार योग्य, गैर tumorigenic, ऑटोलॉगस कोशिका आबादी है कि ऑपरेशन और उनके इसी ऊतक-विशिष्ट SCs1से आणविक रूप से अलग कर रहे है बनाता है । निरंतर याप या कुछ दिनों के लिए TAZ गतिविधि की एक पल्स आत्म नवीकरण दैहिक SCs की उपस्थिति पैदा करने के लिए पर्याप्त है । यह एक स्थिर शर्त है जो अब निरंतर transgene व्यंजक पर निर्भर नहीं है, क्योंकि इसे आगे अस्थानिक याप/TAZ1की अभिव्यक्ति के बिना सेल पीढ़ियों के माध्यम से प्रेषित किया जा सकता है । प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत विवरण de नोवो उपकला स्टेम/जनक कोशिकाओं स्तन ग्रंथि और अग्ंयाशय के उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रिया, इन ऊतकों के विभेदित कोशिकाओं से शुरू । यह कार्यविधि वर्तमान reprogramming/transdifferentiation arena में एक काला बॉक्स भरता है । इन दिशाओं में मुख्य प्रयास वास्तव में अभी तक एक प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) राज्य के लिए सेल संक्रमण पर केंद्रित है, और अधिक विभेदित कोशिकाओं में इन भ्रूण और pluripotent SCs के रूपांतरण के बाद । हालांकि, iPSCs एक बार वयस्क ऊतकों में शुरू tumorigenic रहे हैं, उनके पूर्ण और कुशल भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल विकसित करने की आवश्यकता स्थापना2। हालांकि, यह भेदभाव कदम, जब भी संभव हो, दीर्घकालिक विस्तार, स्वयं संगठन और अंग पुनर्जनसंख्या क्षमता की कीमत पर आता है । ये अंग पुनर्जनन कि वास्तव में विशिष्ट है अंतर्जात ऊतक-विशिष्ट SCs और वर्तमान में वर्णित याप-प्रेरित SCs (ySCs) के लिए आवश्यक गुण हैं । इसी तरह, विभिंन प्रतिलेखन कारकों की कॉकटेल का उपयोग करके दूसरे में एक सेल प्रकार के प्रत्यक्ष transdifferentiation भी विभेदित कोशिकाओं है कि आवश्यक प्रफलन और स्टेम क्षमता की कमी उत्पंन3।
यहां बताई गई प्रक्रिया का भी लाभ लेता है हाल ही में पेश organoid तकनीक का, जिसके द्वारा अंतर्जात SCs का विस्तार और विभेद किया जा सकता है पूर्व वीवो4. याप-प्रेरित SCs प्रयोगात्मक, जैविक या रोग की स्थिति में भी organoid-गठन SCs उत्पन्न कर सकता है जिसमें अंतर्जात SCs मौजूद नहीं हैं. हम ध्यान दें कि, अंय reprogramming प्रक्रियाओं के साथ अंतर पर, सेल याप द्वारा प्रदान की प्लास्टिक की तरह एक अनुसूचित जाति के लिए संस्करण के केवल फार्म के अनुरूप हो सकता है कि स्थिति की तरह रहने वाले ऊतकों में होता है । अनुसूचित जाति के पुनर्अधिग्रहण-जैसे लक्षण ऊतक की मरंमत या oncogenic सक्रियण5के साथ संबद्ध किया गया है । हालांकि कई वयस्क ऊतकों, याप और/या TAZ के homeostasis के लिए औषधालय बिल्कुल पुनर्जनन के लिए आवश्यक हैं, ट्यूमर विकास और दैहिक SCs के विस्तार इन विट्रो में1,6,7,8 ,9,10,11,12
यहां हम वर्तमान प्रोटोकॉल याप के क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा उनके इसी ऊतक-विशिष्ट जनक कोशिकाओं (या ySCs) में विभिंन ऊतकों के पूर्व vivo अंतरित उपकला कोशिकाओं reprogram करने के लिए, के रूप में पहले1बताया । हम विस्तृत दो प्रक्रियाओं है: एक lentiviral वैक्टर के माध्यम से FACS-शुद्ध कोशिकाओं के reprogramming की अनुमति है और एक दूसरा एक कि वायरल संक्रमण से बचा जाता है और ट्रांसजेनिक याप अभिव्यक्ति का लाभ लेता है । प्रत्येक प्रोटोकॉल एक कुशल रणनीति को अलग और संस्कृति प्राथमिक विभेदित कोशिकाओं और exogenous याप विभेदित कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के लिए मजबूर करने के लिए एक रणनीति प्रस्तुत करता है, de नोवो दैहिक ऊतक पैदा विशिष्ट विस्तार योग्य स्टेम कोशिकाओं (देखें आंकड़े 1a और 2a) में योजनाएं ।
हम प्रदर्शन किया है कि अलगाव रणनीतियों यहां प्रस्तुत प्रभावी ढंग से विभेदित कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी को अलग, के रूप में तथ्य यह है कि हम कभी नहीं नकारात्मक नियंत्रण नमूनों से किसी भी वृद्धि का पता चला द्वारा प्रदर्शन (आंकड़े 1C और 2c) ।
lentiviral प्राथमिक स्तन LD कोशिकाओं के reprogramming के लिए इस अध्ययन में प्रयुक्त वैक्टर doxycycline inducible, transgene अभिव्यक्ति का एक तंग नियंत्रण की संभावना की पेशकश कर रहे हैं; यह exogenous पर याप अभिव्यक्ति चालू और बंद करने के लिए अनुमति देता है । विशेष रूप से ध्यान एक अत्यधिक वायरल titer के उपयोग से बचने में रखा जाना चाहिए, क्योंकि यह reprogramming दक्षता के मामले में हानिकारक हो सकता है । प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं के मामले में, हम एक पूरी तरह से ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण को बंद करने के लिए ंयूनतम जोड़तोड़ के साथ एक याप-निर्भर reprogramming प्राप्त करते हैं । इस उत्तरार्द्ध रणनीति प्राथमिक अग्नाशय acini के लिए भी विशेष रूप से उपयुक्त है, अलग कोष्ठकी समूहों के रूप में शायद ही lentiviral संक्रमण और बहुत नाजुक के लिए उत्तरदायी हैं. ट्रांसजेनिक रणनीति कार्यरत जीन अभिव्यक्ति के तंग नियंत्रण के लिए doxycycline-निर्भर lentiviral वैक्टर का ही लाभ प्रदान करता है । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक प्राथमिक अग्नाशय acini के साथ शोषण की रणनीति एक बहुत उच्च reprogramming के वायरल की तुलना में दक्षता के अतिरिक्त लाभ भालू-स्तन LD कोशिकाओं के पुनः प्रोग्रामिंग प्रेरित । अलग आंतरिक विभिंन ऊतकों से व्युत्पंन कोशिकाओं से जुड़े प्लास्टिक के पार, अग्नाशय reprogramming की उच्च दर से प्राप्त किया जा सकता है अभिव्यक्ति की उच्च दक्षता से जुड़े सभी में वर्दी और स्वायत्त याप अभिव्यक्ति explanted कक्ष । विशेष रूप से, हम exogenous याप अब ySCs (yMaSC कालोनियों और yDucts) की पीढ़ी के बाद की आवश्यकता है, अपने स्वयं के नवीकरण की क्षमता को प्रभावित किए बिना प्रदर्शित किया है । इसका कारण यह है कि ySCs पुनः सक्रिय अंतर्जात याप/TAZ और उन्हें स्व-नवीकरण के लिए उपयोग करते समय exogenous याप बंद कर दिया जाता है1.
हम धारणा है कि ySCs वास्तव में आनुवंशिक वंश के माध्यम से हमारे reprogramming प्रयोगों की उत्पत्ति की कोशिका को नियंत्रित करने के द्वारा विभेदित कोशिकाओं से उभरने पुष्टि-वैध पता अनुरेखण1।
ySCs के व्यापक लक्षण वर्णन से पता चलता है कि याप प्रेरित reprogramming सामांय दैहिक SCs1 के रूप में transcriptomic स्तर पर उत्पंन करता है, ySCs प्रदर्शन बड़े पैमाने पर देशी SCs के साथ ओवरलैप; ii) ySCs प्रदर्शन अंतर क्षमता और एक multilineage संतति उत्पन्न कर सकते हैं हमेशा मूल के अपने ऊतक की पहचान करने के लिए प्रतिबंधित; iii) ySCs में गैर-रूपांतरित और गैर-tumorigenic होते है जब vivo मेंप्रत्यारोपण होता है ।
यहां हम भी प्रक्रियाओं का वर्णन को बनाए रखने और संस्कृति में विस्तार दोनों yMaSCs और yDucts organoids के रूप में १००% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स hydrogels में एंबेडेड । इन शर्तों स्वयं के लिए अनुमति ySCs के संगठन तीन आयामी organoids में है कि उपजी गुण लंबे समय के रखरखाव को सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति में अवधि, बहाव विश्लेषण और अनुप्रयोगों के लिए होगा पर इन स्टेम आबादी का विस्तार करने के लिए सक्षम करने से । अज्ञात कारणों के लिए, हम संक्रमित एलडी कोशिकाओं organoid संस्कृति की स्थिति में सीधे doxycycline प्लास्टिक ऊतक संस्कृति की थाली में उपचार के बाद 7 दिनों रखकर yMaSC organoids प्राप्त करने में विफल; दूसरे शब्दों में, स्तन कॉलोनी की स्थिति में मध्यवर्ती विकास कदम आवश्यक है । हमारे हाथ में, यहां तक कि देशी MaSCs organoid संस्कृति में passaging से पहले स्तन कॉलोनी शर्तों की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, सबसे कुशल organoid वृद्धि प्राप्त की है जब हम एक ही कक्ष में प्राथमिक कालोनियों dissociating से बचने के लिए, बल्कि organoid संस्कृति की स्थिति में बरकरार कालोनियों हस्तांतरण ।
Organoid कल्चरल स्थितियाँ भी cryopreserve ySCs को संभावना देने का लाभ वहन करते हैं, बशर्ते कि organoids को उनके मैट्रिक्स से बरामद कर लिया जाए, कोशिका पृथक्करण से परहेज करने से पहले नाइट्रोजन स्नान में cryopreservation.
याप reprogramming प्रक्रिया अलग विभेदित सेल उनके इसी ऊतक में विभिंन वयस्क ऊतकों से व्युत्पंन प्रकार विशिष्ट स्टेम कोशिकाओं को परिवर्तित कर सकते है (हम इसे स्तन का उपयोग कर परीक्षण किया है, अग्नाशय और ंयूरॉन कोशिकाओं)1। iPSCs या अंय reprogramming प्रयासों से अंतर पर, याप/प्रेरित SCs मूल के अपने ऊतक की यादें बनाए रख सकते हैं । नोट की, स्टेम की तरह गुणों के साथ संपंन कोशिकाओं में दैहिक कोशिकाओं के de-भेदभाव सेल भाग्य प्लास्टिक और vivo में मनाया reprogramming के एकमात्र रूप है, उदाहरण के लिए ऊतक क्षति के बाद और घाव भरने का समर्थन करने के लिए5,17 , 18 , 19 , 20. यह उल्लेखनीय है कि याप और TAZ सामान्य homeostasis के लिए काफी हद तक औषधालय हैं लेकिन कई ऊतकों में ऊतक की मरम्मत के लिए महत्वपूर्ण हैं11,21. लगातार reprogramming कदम के एक शारीरिक समारोह के साथ यहां वर्णित है, याप/TAZ हाल ही में एक वयस्क आंत्र कोशिकाओं का रूपांतरण के कारण द्वारा अल्सरेटिव कोलाइटिस रोगियों के माउस मॉडल में आंत्र पुनर्जनन में आवश्यक हो दिखाया गया है एक मरंमत उपकला कि भ्रूण आंत19की सुविधाओं को प्रदर्शित करता है । याप reprogramming इस प्रकार एक दैहिक स्टेम सेल, एक राज्य है कि अब तक इन विट्रो मेंकब्जा करने के लिए चुनौतीपूर्ण है उत्पंन करने का साधन प्रदान करके वर्तमान प्रेरित सेल प्लास्टिक की रणनीतियों का विस्तार । यह दृष्टिकोण, मानव-व्युत्पन्न कोशिकाओं के लिए भी विस्तारित है, दैहिक उपजी स्थिति के अध्ययन के लिए और दैहिक स्टेम कोशिकाओं के विस्तार के लिए reअपक्षयी दवा अनुप्रयोगों से व्यापक प्रासंगिकता हो सकता है इन विट्रो में।
The authors have nothing to disclose.
हम tetO-यापS127A चूहों के उपहार के लिए F. Camargo धंयवाद; R26-rtTAM2 चूहों (स्टॉक #006965) को जैक्सन लेबोरेटरी से खरीदा गया । हम FACS प्रक्रियाओं के साथ मदद के लिए चियारा Frasson और ग्यूसेप Basso धंयवाद । यह काम AIRC विशेष कार्यक्रम आणविक नैदानिक ऑन्कोलॉजी ‘ ‘ 5 प्रति मिल ‘ ‘ और एक AIRC पीआई-एस. पी करने के लिए अनुदान द्वारा समर्थित है, और Epigenetics फ्लैगशिप परियोजना CNR-Miur अनुदान सपा के द्वारा इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (ग्रांट एग्रीमेंट DENOVOSTEM No. ६७०१२६) के तहत यूरोपियन रिसर्च काउंसिल (ईआरसी) से फंडिंग मिली है ।
10 mL sterile syringes | Rays | 10LC | |
100 mm cell strainer | Corning | 352360 | |
15 mL sterile conical tubes | Corning | 430052 | |
24-well ultra low attachment plates | Costar | 3473 | |
40 mm cell strainers | Corning | 352340 | |
48-well multiwell plates | Corning | 353078 | |
50 mL sterile conical tubes | Corning | 430290 | |
6-well multiwell plates | Corning | 353046 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634028 | |
B27 supplement (50x) | Gibco | 17504001 | |
BPE | Gibco | 13028014 | |
BSA | Sigma | A9418 | |
Collagenase, type I | Sigma | 17018029 | |
dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Dispase | Gibco | 1705-041 | |
Disposable scalpels | Swann-Morton | 0503 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
DnaseI | Roche | 11284932001 | |
doxycycline hyclate | Sigma | D9891 | |
EDTA | Sigma | E5134 | |
Ethanol 100% | Sigma | 51976 | |
FACS tubes (with strainer caps) | Falcon | 352235 | |
FBS | Gibco | 10270106 | |
FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM) | BioLegend | 118208 | |
FUdeltaGW-rtTA | Addgene | #19780 | |
FUW-tetO-EGFP | Addgene | #84041 | used as negative control |
FUW-tetO-MCS | Addgene | #84008 | used as negative control |
FUW-tetO-wtYAP | Addgene | #84009 | |
FUW-tetO-YAPS94A | Addgene | #84010 | used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant) |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | |
HBSS | Gibco | 24020117 | |
HCl | Sigma | 30721 | |
heparin sodium salt | Sigma | H3149 | |
HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
human R-Spondin1 (His Tag) | Sino Biological | 11083-H08H-5 | |
Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506 | |
ITS-X | Gibco | 51500056 | |
K-14 antibody | Life Technologies | Ab7800 | |
K-8 antibody | Life Technologies | Ab14053 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail) | BD Biosciences | 51-9003632 | |
Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
NaOH | J.T.Baker | 0402 | |
NH4Cl | Sigma | A9434 | |
Nicotinamide | Sigma | 72340 | |
non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish ø 94) | ROLL | 18248 | |
PBS 10x | Euroclone | ECM4004XL | |
PE Hamster Anti-Mouse CD61 | BD Biosciences | 553347 | |
PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f | BD Biosciences | 551129 | |
PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody | BioLegend | 102222 | |
Pen/Strep (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Rat Tail Collagen I (coating) | Sigma | 122-20 | |
Rat Tail Collagen I for 3D culture | Cultrex | 3447-020-01 | |
recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
recombinant murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
recombinant murine FGF basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
RPMI 1640 medium | Gibco | 31870025 | |
SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max) | Sigma | T6522 | |
Tris BASE | Roche | 11814273001 | |
Trypsin-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
Waymouth medium | Gibco | 31220023 |