Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen
Summary
We beschrijven de detectie van NLRP3 inflammasome activering op cellulaire basis met behulp van fluorescentie microscopie en kleuring voor actieve caspase-1 en de adapter, ASC. Een lactaat dehydrogenase release assay wordt gepresenteerd voor het detecteren van lysis van de pyroptotic op basis van de bevolking. Deze technieken kunnen worden aangepast om te bestuderen van vele aspecten van inflammasome biologie.
Abstract
Inflammasomes zijn aangeboren immuun signalering platforms die vereist zijn voor de succesvolle bestrijding van vele pathogene organismen, maar ook bevordering van inflammatoire en autoinflammatory ziekten. Inflammasomes worden geactiveerd door cytosolische patroon erkenning receptoren, waaronder leden van de familie knik-achtige receptor (NLR). Deze receptoren oligomerize op het opsporen van microbiële of schade-geassocieerde stimuli. Latere indienstneming van de adapter proteïne ASC vormt een microscopisch zichtbaar inflammasome complex, die caspase-1 t/m nabijheid-geïnduceerde auto-activering activeert. Na het activeren cleaves caspase-1 pro-IL-1β en pro-IL-18, wat leidt tot de activering en de secretie van deze pro-inflammatoire cytokines. Caspase-1 bemiddelt ook de inflammatoire vorm van celdood genoemd pyroptosis, die beschikt over het verlies van lysis van de membraan integriteit en cel. Caspase-1 cleaves gasdermin D, het vrijgeven van het N-terminaal fragment dat vormt plasmamembraan poriën, wat leidt tot lysis van de osmotische.
In vitro, de activering van caspase-1 kan worden bepaald door het labelen van beenmerg-afgeleide macrofagen met de activiteit van de caspase-1 sonde FAM-YVAD-FMK en labelen van de cellen met antistoffen tegen het eiwit adapter ASC. Deze techniek maakt het mogelijk de identificatie van de inflammasome formatie en caspase-1 activering in afzonderlijke cellen met behulp van fluorescentie microscopie. De dood van de cel van de Pyroptotic kan worden gedetecteerd door het meten van de release van cytosolische lactaat dehydrogenase in het medium. Deze procedure is eenvoudig, kosteneffectief en uitgevoerd in een 96-wells-plaat-indeling, waardoor aanpassing voor screening. In dit manuscript, laten we zien dat de activering van de inflammasome van de NLRP3 door nigericin leidt tot de co lokalisatie van de adaptor eiwitten ASC en actieve caspase-1, wat leidt tot pyroptosis.
Introduction
Inflammasome-gemedieerde ontsteking is een essentieel onderdeel van de verdediging tegen pathogene organismen1, maar ook ten grondslag ligt aan de etiologie van vele ziekten2. De inflammatoire respons voor een groot aantal infecties wordt geactiveerd door cytosolische opsporing van pathogen verbonden moleculaire patronen (PAMPs) of schade geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs). Patroon erkenning receptoren (PRR), met inbegrip van leden van de familie van de knik-achtige receptor (NLR), oligomerize na de detectie van deze PAMPs en DAMPs. Dit veroorzaakt de vorming van een multi eiwit complex genoemd de inflammasome, waarin de PRR, de adapter proteïne Apoptosis-geassocieerde speck-achtige eiwitten met een C-terminal caspase-recruitment domein (kaart) (ASC), en de Pro-vorm van caspase-13,4. Dit complex staat nabijheid-geïnduceerde auto-activering van caspase-1. Actieve caspase-1 leidt vervolgens tot een reeks van gebeurtenissen die karakteristiek voor de inflammatoire cel dood traject pyroptosis zijn. Deze gebeurtenissen omvatten: het splijten en de introductie van de inflammatoire cytokines IL-1β en de IL-18, lysosoom exocytose met introductie van lysosomale inhoud in de extracellulaire ruimte, nucleaire condensatie en gasdermin D decollete. De vrijgegeven N-terminale domein van gasdermin D wordt ingevoegd in het plasma-membraan, vorming van poriën waardoor plasmamembraan breuk en vrijlating van inflammatoire inhoud, naast een beschermende niche voor pathogen replicatie5, weg te nemen 6 , 7.
Hier focussen we op de goed bestudeerde NLRP3 inflammasome. De activering van de inflammasome van de NLRP3 vindt plaats via een proces in twee fasen8. De eerste stap van het “priming” vindt plaats via de erkenning door Toll-like receptors (TLR) van een microbiële product. Dit wordt gerepliceerd in het laboratorium-omgeving met behulp van LPS TLR4 stimuleren. Deze stimulatie upregulates NLRP3 en pro-IL-1β door signalering van NF-kB. Bovendien priming licenties NLRP3 via niet-transcriptionele mechanismen door inducerende haar deubiquitination9,10 en fosforylering of defosforylerings van bepaalde residuen11,12.
Het tweede signaal voor NLRP3 activering wordt gedacht aan het betrekken van mitochondriale factoren, reactieve zuurstof soorten, efflux van kalium en calcium signalering, hoewel een verenigende mechanisme voor NLRP3 activering ongrijpbaar8 blijft. Geactiveerde NLRP3 oligomerizes door middel van interacties tussen de domeinen van de NACHT, en ASC werft via de binding van de pyrin (PYD) domeinen13. In elke cel vormen deze macromoleculaire complexen een enkele microscopisch zichtbaar focus. ASC werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een 22 KDa proteïne die vormt een “vlekje” tijdens de apoptosis van menselijke leukemie cellen en benoemde apoptosis-geassocieerde speck-achtige eiwitten met een kaart14. Later werd vastgesteld dat ASC pro-caspase-1 door de interactie van de kaart van ASC met de kaart van pro-caspase-1 werft, vormen de inflammasome15.
Niet alle NLRs vereisen de aanwezigheid van ASC ertoe caspase-1 activering. In tegenstelling tot NLRP3, NLRC4 en NLRP1b CARD domeinen hebt en pro-caspase-1 via CARD-CARD interacties voor het opwekken van caspase-1 activering rechtstreeks kunnen aanwerven. Bij gebrek aan ASC, actieve caspase-1 blijft diffuus in het cytosol en vormt niet een interne focus. Dit diffuse actieve caspase-1 is voldoende voor het opwekken van de dood van de cel van de pyroptotic, maar is niet pro-IL-1β13,16te verwerken.
In dit manuscript, zullen we beoordelen inflammasome activeren op twee manieren. De eerste maakt gebruik van de fluorescerende activiteit probe, FAM-YVAD-FMK, die bindt de caspase-1 familie van proteasen. Deze familie omvat caspase-1, maar ook de muis caspase-11 en menselijke caspase-4 en caspase-5. Met behulp van macrofagen van caspase-1/11 deficiënte muizen in alle experimenten, zal de specificiteit van deze sonde worden aangepakt. Deze methode kan worden gecombineerd met het antilichaam labeling van componenten van de inflammasome, die we ook zullen beschrijven. Microscopische visualisatie maakt de identificatie van de individuele cellen met actieve caspase-1 en oligomerized ASC. Met behulp van deze methode, zal onderzoekers kunnen bepalen waar in de inflammasome formatie cascade hun manipulaties van de gastheercel of het ziekteverwekkende organisme onder studie een effect hebben. Men kan bijvoorbeeld, of een bepaalde interventie voorkomt u dat de aanwerving van ASC tot de complexe NLRP3 richt zich op de latere werving en activering van caspase-117onderscheiden. Behandeling van de resultaten van caspase-1 activering zoals IL-1β afscheiding zou niet kunnen onderscheid maken tussen deze twee mogelijkheden. Ook kan de secretie van IL-1β worden gewijzigd zonder dat het vermogen van de cellen te activeren caspase-1 en pyroptotic cel dood16ondergaan.
De tweede methode meet de introductie van lactaat dehydrogenase (LDH) in de cel supernatant, die optreedt tijdens pyroptotic macrofaag lysis caspase-1 activering na zoals hierboven beschreven. Deze tweede methode is een populatie gebaseerde benadering het uitbrengen van LDH in het hele goed is gemeten. Deze eenvoudige aanpak zorgt voor de snelle analyse (30 min van incubatietijd) van monsters om te bepalen als er caspase-1-gemedieerde celdood en kan worden uitgevoerd in een 96-wells-plaat-indeling.
Deze methoden zijn complementair, elk met verschillende voordelen, en beide zijn gemakkelijk vatbaar voor wijzigingen. Macrophage behandeling met gerichte kleine molecuulgewicht verbindingen vóór inflammasome stimulatie kan bijvoorbeeld worden gebruikt te onderzoeken van de rol van bepaalde eiwitten kunnen hebben over de beheersing van de inflammatoire reacties.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit manuscript, hebben we twee technieken te onderzoeken inflammasome activering en het gevolg van caspase-1 activering na stimulatie van de NLRP3 in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen gepresenteerd. De eerste techniek laat toe de onderzoeker om te bepalen van het niveau van caspase-1 activering op basis van de fluorescerende verslaggever FAM-YVAD-FMK een cellulaire. Deze verslaggever is zeer specifiek voor het binden van de caspase-1 familie van enzymen, zoals gezien door het ontbreken van kleuring in caspas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle microscopie werd uitgevoerd bij het W. M. Keck microscopie centrum met steun van Nathaniel Peters en met ondersteuning van NIH award S10OD016240. S.L.F. wordt ondersteund door de NIH K08AI119142 en R21AI130281. Wij danken Dr. Richard Flavell en Dr. Brad Cookson voor caspase-1/11 deficiënte muizen, en Dr. Brad Cookson voor het delen van laboratoriumfaciliteiten en apparatuur.
Materials
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
Riferimenti
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
- Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
- Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
- Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
- Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
- Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
- Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
- LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
- Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
- Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
- Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
- Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
- DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
- Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
- Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).
