Påvisande av Inflammasome aktivering och Pyroptotic celldöd i murina benmärg-derived makrofager
Summary
Vi beskriver påvisande av NLRP3 inflammasome aktiveringen på cellulära basis använda fluorescensmikroskopi och färgning för aktiva kaspas-1 och adapter, ASC. En laktatdehydrogenas release assay presenteras för att upptäcka pyroptotic Lys på basis av befolkningen. Dessa tekniker kan anpassas för att studera många aspekter av inflammasome biologi.
Abstract
Inflammasomes är medfödd immun signalering plattformar som krävs för framgångsrik bekämpning av många patogena organismer, men också främja inflammatoriska och autoinflammatoriska sjukdomar. Inflammasomes aktiveras av cytosoliska mönster erkännande receptorer, inklusive medlemmar av familjen nicka-like receptor (NLR). Dessa receptorer oligomerize vid detektion av mikrobiell eller skada-associerade stimuli. Efterföljande rekrytering av proteinet adapter ASC bildar ett mikroskopiskt synlig inflammasome komplex, som aktiverar kaspas-1 genom närhet-inducerad auto-aktivering. Efter aktiveringen klyver kaspas-1 pro-IL-1β och pro-IL-18, vilket leder till aktivering och utsöndring av dessa pro-inflammatoriska cytokiner. Kaspas-1 förmedlar också inflammatoriska form av celldöd kallas pyroptosis, vilken dragen förlusten av membran integritet och cell lysis. Kaspas-1 klyver gasdermin D, släppa den N-terminala fragment som bildar plasmamembranet porer, vilket leder till osmotisk Lys.
In vitro, aktivering av kaspas-1 kan bestämmas genom märkning benmärg-derived makrofager med sonden kaspas-1-aktiviteten FAM-YVAD-FMK och märkning cellerna med antikroppar mot proteinet adapter ASC. Denna teknik möjliggör identifiering av inflammasome bildning och kaspas-1 aktivering i enskilda celler med fluorescensmikroskopi. Pyroptotic celldöd kan upptäckas genom att mäta utsläpp av cytosoliska laktatdehydrogenas i mediet. Proceduren är enkel, kostnadseffektiv och utförda i en plattan med 96 brunnar format, tillåter anpassning för screening. I detta manuskript visar vi att aktivering av den NLRP3-inflammasome av nigericin leder till samtidig localizationen av adapter protein ASC och aktiva kaspas-1, vilket leder till pyroptosis.
Introduction
Inflammasome-medierad inflammation är en viktig del av försvaret mot patogena organismer1, men ligger också bakom etiologi av många sjukdomar2. Den inflammatoriska reaktionen till en rad infektioner utlöses av cytosoliska upptäckt av patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) eller skador associerade molekylära mönster (dämpar). Mönster erkännande receptorer (PRR), däribland medlemmar av familjen nicka-like receptor (NLR), oligomerize vid påvisande av dessa PAMPs och dämpar. Detta utlöser bildandet av flera proteinkomplex som kallas den inflammasome, som innehåller PRR, proteinet adapter apoptos-associerade speck-liknande protein som innehåller en C-terminal kaspas-rekrytering domän (kort) (ASC) och Pro form av kaspas-13,4. Detta komplex tillåter närhet-inducerad auto-aktivering av kaspas-1. Aktiva kaspas-1 leder sedan till en uppsättning händelser som är karakteristiska för den inflammatoriska celler död väg pyroptosis. Dessa händelser inkluderar: den klyvning och lanseringen av den inflammatoriska cytokiner IL-1β och IL-18, Lysosomen exocytos med utsättning av lysosomala innehållet i den extracellulära, nukleär kondensation och gasdermin D klyvning. Släppta N-terminala domänen för gasdermin D infogar i plasmamembranet, bildar porer som orsakar plasmamembranet bristning och frisättning av inflammatoriska innehållet, förutom att ta bort en skyddande nisch för patogen replikering5, 6 , 7.
Här fokuserar vi på de väl studerat NLRP3-inflammasome. Aktivering av den NLRP3-inflammasome sker genom en två-stegs process8. Det första ”priming” steget sker genom erkännande av Toll-liknande receptorer (TLR) av en mikrobiell produkt. Detta replikeras i inställningen laboratorium med hjälp av LPS för att stimulera TLR4. Denna stimulering uppreglerar NLRP3 och pro-IL-1β genom NF-kB signalering. Grundning dessutom licenser NLRP3 genom icke-transkriptionell mekanismer genom att inducera dess deubiquitination9,10 och fosforylering eller Defosforylering av specifika rester11,12.
Den andra signalen för NLRP3 aktivering tros innebära mitokondriell faktorer, reaktiva syreradikaler, kalium efflux och calcium signalering, även om en enande mekanism för NLRP3 aktivering fortfarande gäckande8. Aktiverade NLRP3 oligomerizes genom samverkan mellan dess NACHT domäner och rekryterar ASC via bindning av pyrin (PYD) domäner13. I varje cell bildar dessa makromolekylärt komplex en enda mikroskopiskt synlig fokus. ASC identifierades ursprungligen som ett 22 KDa-protein som bildar en ”speck” under apoptos mänskliga leukemiceller och namngivna apoptos-associerade speck-liknande protein som innehåller en kort14. Det fastställdes senare att ASC rekryterar pro-kaspas-1 genom samverkan mellan kortet i ASC med kortet för pro-kaspas-1, bildar de inflammasome15.
Inte alla NLR kräver närvaro av ASC inducera kaspas-1 aktivering. Till skillnad från NLRP3, NLRC4 och NLRP1b har kort domäner och direkt kan rekrytera pro-kaspas-1 via kort-kort interaktioner att inducera kaspas-1 aktivering. I avsaknad av ASC, aktiva kaspas-1 fortfarande diffust i hela cytosolen och utgör inte en enda fokus. Denna diffusa aktiva kaspas-1 är tillräcklig för att framkalla pyroptotic celldöd, men inte behandla pro-IL-1β13,16.
I detta manuskript, kommer vi att diskutera två sätt att bedöma inflammasome aktivering. Först använder aktiviteten fluorescerande sond, FAM-YVAD-FMK, som binder kaspas-1 familjen av proteaser. Denna familj omfattar kaspas-1, men även mus kaspas-11 och mänskliga kaspas-4 och kaspas-5. Med hjälp av makrofager från kaspas-1/11 bristfällig möss i alla experiment, behandlas specificiteten av denna sond. Denna metod kan kombineras med antikropp märkning av inflammasome komponenter, som vi också kommer att beskriva. Mikroskopiska visualisering möjliggör identifiering av enskilda celler som innehåller aktiva kaspas-1 och oligomerized ASC. Med den här metoden kommer forskare att kunna avgöra var i inflammasome formation kaskad sina manipulationer av värdcellen eller den patogena organismen under studien har en effekt. Man kan till exempel skilja oavsett om en viss intervention förhindrar rekrytering av ASC till den komplexa NLRP3 eller de efterföljande rekrytering och aktivering av kaspas-117. Granskar resultat av kaspas-1 aktivering såsom IL-1β sekretion skulle inte kunna skilja mellan dessa två möjligheter. Utsöndring av IL-1β kan också ändras utan att ändra celler förmågan att aktivera kaspas-1 och genomgå pyroptotic cell död16.
Den andra metoden mäter utsläpp av laktatdehydrogenas (LDH) i cellen supernatanten, som inträffar under pyroptotic makrofag lysis efter kaspas-1 aktivering som beskrivs ovan. Denna andra metod är ett populationsbaserat tillvägagångssätt som lanseringen av LDH i hela väl mäts. Denna enkla metod tillåter snabb analys (30 min av inkubationstiden) av prover för att avgöra om det finns kaspas-1-medierad celldöd och kan utföras i ett format som plattan med 96 brunnar.
Dessa metoder är kompletterande, alla med olika fördelar, och båda är lätt bli föremål för ändringar. Makrofag behandling med riktade liten molekylvikt föreningar före inflammasome stimulering kan exempelvis användas för att undersöka rollen vissa proteiner kan ha på att kontrollera inflammatoriskt svar.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta manuskript, har vi presenterat två tekniker för att undersöka inflammasome aktivering och följden av kaspas-1 aktivering NLRP3 stimulering i murina benmärg-derived makrofager. Den första tekniken gör det möjligt för forskaren att bestämma nivån på kaspas-1 aktivering på en cellulär grundval fluorescerande reportern FAM-YVAD-FMK. Denna reporter är mycket specifika för bindande kaspas-1 familjen av enzymer, som ses av avsaknad av färgning i kaspas-1/11 bristfällig makrofager. Specificitet visades …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alla mikroskopi gjordes på W. M. Keck mikroskopi Center med stöd av Nathaniel Peters och med stöd av NIH award S10OD016240. S.L.F. stöds av NIH K08AI119142 och R21AI130281. Vi tackar Dr. Richard Flavell och Dr Brad Cookson för kaspas-1/11 bristfällig möss, och Dr Brad Cookson för att dela laboratorier och utrustning.
Materials
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
Riferimenti
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
- Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
- Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
- Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
- Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
- Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
- Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
- LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
- Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
- Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
- Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
- Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
- DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
- Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
- Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).
