エクソソームおよび人間の血液からの分離を最適化するためにタンパク質の消化が、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー
Summary
ここでは、プラズマと非 exosomal 血蛋白質の減らされた共同浄化と血清の両方からエクソソームを浄化するためのプロトコルを提案する.最適化されたプロトコルには、限外ろ過には、プロテアーゼ処理, サイズ排除クロマトグラフィーが含まれます。小胞とプロテオーム解析のより正確な定量化を含むエクソソーム利点下流解析の強化された浄化。
Abstract
エクソソーム、nanovesicle すべての細胞型からリリースの種類は、任意の体液から分離できます。などのタンパク質と Rna、エクソソームの内容は、そこから派生し、病の指標として使用することができます細胞に固有です。遠心を含む、いくつかの一般的な濃縮プロトコルは、可溶性蛋白質の汚染物を積んだエクソソームを得られます。具体的には、我々 を発見した血液内の最も豊富な蛋白質はしばしば共同エクソソームの浄化し、下流プロテオーム研究を混同することができます低豊富なバイオ マーカー候補の同定を阻止します。更なる懸念エキソソーム タンパク質定量非 exosomal タンパク質レベルの矛盾した表現のための irreproducibility です。エキソソーム精製プロセスに厳しさを追加するエクソソームと共に共同浄化非 exosomal 蛋白質を削除するここで詳細なプロトコルが開発されました。5 つのメソッドは、ペアの血血しょうおよび 5 つのドナーからの血清を使用して比較しました。トラッキング解析とマイクロ ビシンコニン酸蛋白質の試金ナノ粒子を用いた解析では、限外ろ過とサイズ排除クロマトグラフィーを利用した複合的なプロトコルが最適な小胞の濃縮と可溶性タンパク質を除去をもたらしたことを明らかにしました。西部にしみが付くことは、予想される豊富な血蛋白質、アルブミンやアポ蛋白などが枯渇したことを確認する使用されました。
Introduction
エクソソームは nanovesicles (30 サイズに至るまで 150 nm nm) 細胞間コミュニケーションを促進する1,2を処理する人間の体のほぼすべてのセルが発表しました。興味深いことに、エクソソームの組成は、起源の細胞だけでなく、個々 の3,4、5の状態に応じて変更します。また、エクソソームから取得できるいくつかの生物学的流体など: 唾液、尿、血2。これらの機能によりエクソソームは病のバイオ マーカーの良い情報源と見なされます。残念ながら、エクソソームの隔離のための標準的な方法はありません。いくつかの研究所では、多段遠心、エキソソーム分離法のゴールド スタンダードとしての密度勾配を使用して 100,000 × g で最後の高速ステップを検討してください。しかし、最近の研究はその遠心水溶性タンパク質とエクソソームとエキソソーム整合性、どちらが下位アプリケーション6,7 を妨げる可能性がありますに影響を与えるだけでなく、他のエクソソームの凝集を誘導する示されています。.エキソソーム分離の他の一般的な方法に限定されない: 商業ポリエチレング リコール (PEG) 沈殿物ベースの試薬、遠心限外濾過法、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)。ポリエチレング リコール (PEG) 高分子を用いた市販の試薬に沈殿し、ペレットを形成させることによりエクソソームを豊か。このポリマーを使用して制限は、残留ペグ ポリマーと最終製品に可溶性の非 exosomal 蛋白質の豊富な汚染です。限外濾過を利用して浄化し、セルロース膜を使用して小胞を集中する遠心分離小さい不純物や他のタンパク質が膜7、8を通過中、エクソソームはフィルター上保持されます。他の方法と同様遠心限外濾過法非 exosomal 蛋白質、タンパク質凝集体などの高レベルの保持のためエクソソームを浄化するために限られた能力があります。最後に、SEC の浄化は、サイズによって分子を分離するのに多孔質樹脂を使用します。SEC は有望な結果を示している汚染タンパク質の大部分をキャプチャして以来、分離のに基づいて重力または低圧システム7、exosomal の整合性を維持する他の方法で直面している問題のほとんどを克服します。 9。ただし、秒の中に大きいタンパク質凝集体とリポタンパク質10の共同分離最終エキソソーム準備の純度に影響します。エキソソーム浄化のみプラズマ9,11やプラズマ7、細胞培養上清からのいくつかのメソッドがテストされている間血を直接比較するメソッドのパフォーマンスに関する情報がないです。プラズマと同じ個人からの血清。
ここでは、様々 な小胞濃縮技術はプラズマと血清の翻訳可能なかどうかを決定するためのワークフローを比較することによって血中エクソソームの浄化に着目します。ナノ粒子追跡分析および西部のしみは、最終製品におけるエキソソーム濃度、純度、およびタンパク質組成の違いを定量化する使用されました。最後のメソッドは、このプロトコルの詳細は小胞の数の増加し、非 exosomal 蛋白質のレベルを減らします。重要なは、一般的な共同沈降蛋白質アルブミンやアポ蛋白などの大幅な削減が示されています。血と、彼ら共同浄化エクソソームと原因矛盾下流解析の傾斜「浄化」のサンプル周波数でこれら 2 つのタンパク質の高い豊富。このプロトコルを含む市販秒樹脂;樹脂多孔質ビーズ 700 kDa より小さい蛋白質がビーズを入力することができますで構成されます。一度中、蛋白質は octylamine リガンドによって保持されます。溶出液はエクソソームと 700 kDa12よりも大きい分子から成る。また、タンパク質凝集体とビーズのトラップを回避するとアポリポタンパクを減らすために、我々 はワークフローのプロテアーゼ消化手順を含めます。現在がない単一の技術共同浄化非 exosomal 蛋白質を削減しながらエキソソーム収量を最大化することができます。本研究を示しますエキソソーム収量および血清および血漿から純度を高めるため複数の回復そして浄化の方法がプロテアーゼ消化前処理を組み合わせた浄化のプロトコルが使えます。
Protocol
Representative Results
Discussion
純度と血液からエクソソームの収量を高めるために最適化されたメソッドがいくつかの疾患のための biomarkers の源として細胞小胞を正確に私に能力を増加します。標準的な方法、エクソソームを具体的には、分離する現在使用されている遠心とエキソソーム集計の可溶性タンパク質7,17、ペレットなどいくつかの欠点を持っている沈殿物メソッ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、内部資金 (KMD) に CSU、ATCC 契約 #2016-0550-0002 (NIAID HHSN272201600013C の下請け)、ビルおよびメリンダ ・ ゲイツ財団 (OPP1039688) から (KMD/NKG) によって支えられました。追加のサポートのコロラド州立大学で大学生 (REU) 夏プログラムの NSF の研究経験に感謝いたします。
Materials
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
Riferimenti
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M. Proteinase K (EC 3.4.21.14). Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
