La determinazione della specificità della proteasi nel Mouse tessuto estratti mediante spettrometria di massa MALDI-TOF: manipolazione di PH per causare i cambiamenti di specificità

Hiroyuki Yamamoto; Yoshikazu Sawaguchi; Michio Kimura

doi:10.3791/57469

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Articolo metodologico

La determinazione della specificità della proteasi nel Mouse tessuto estratti mediante spettrometria di massa MALDI-TOF: manipolazione di PH per causare i cambiamenti di specificità

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DOI:

10.3791/57469

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25 maggio 2018

Hiroyuki Yamamoto¹ , Yoshikazu Sawaguchi² , Michio Kimura¹

¹Department of Microbiology and Molecular Cell Biology, Nihon Pharmaceutical University, ²Department of Clinical Pharmaceutics, Nihon Pharmaceutical University

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per determinare la specificità di proteasi in tessuto grezzo del mouse estratti usando spettrometria MALDI-TOF.

Abstract

Proteasi hanno diverse funzioni biologiche, tra cui la digestione della proteina di attivazione/inattivazione e cibo. Identificazione della proteasi specificità è importante per rivelare la funzione di proteasi. Il metodo proposto in questo studio determina la specificità della proteasi misurando il peso molecolare dell'unici substrati utilizzando Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization spettrometria di massa di tempo di volo (MALDI-TOF). I substrati contengono iminobiotin, mentre il sito fenduto è composto da aminoacidi, e il distanziatore è costituito da polietilene glicole. Il substrato fenduto genererà un unico peso molecolare usando un aminoacido spaccato. Uno dei meriti di questo metodo è che può essere effettuata in una pentola utilizzando campioni di greggi, ed è anche adatto per valutare campioni multipli. In questo articolo, descriviamo un metodo sperimentale semplice ottimizzato con campioni estratti dal tessuto polmonare di topo, compresa l'estrazione del tessuto, inserimento di substrati digestivi in campioni, purificazione dei substrati digestivi in condizioni di pH diversi e la misurazione del peso molecolare dei substrati utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF. In sintesi, questa tecnica consente l'identificazione della specificità di proteasi in campioni grezzi derivati da estratti di tessuto mediante spettrometria di massa MALDI-TOF, che facilmente può essere scalata per elaborazione di campione più.

Introduzione

Proteasi regolano processi fisiologici fendendo proteine, e l'avvio di attività di proteasi a orari specifici e posizioni è regolato¹. Pertanto è importante per identificare l'espressione e l'attività dei tessuti che sono regolate localmente e per sviluppare un nuovo metodo per rilevare le proteasi. Il metodo proposto questo studio mira a identificare le specificità di proteasi in parallelo al rilevamento di proteasi.

Ci sono alcuni metodi per la rilevazione di specificità di proteasi. Il metodo azocaseina è ben noto per il suo utilizzo nella rilevazione di proteasi² ma è limitato nella sua ca....