회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여
Summary
포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 표본 인간의 질병의 분자 biomarkers의 귀중 한 소스를 나타냅니다. 여기 우리는 실험실 기반 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜, 처음 신선한 냉동된 RNA로 설계 하 고 최적화 된 조직에서 보관 된 microRNAs 분석 저장 최대 35 년 제시.
Abstract
-보관, 임상 분류 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 암 개발의 회고전 분자 연구에 대 한 핵 산을 제공할 수 있습니다. 사용 하 여 나중에 침략 적인 질병을 개발 하는 환자에서 비 침 습 또는 미리 악성 병 변, 진 식 분석 암 위험을 predispose 초기 분자 변경 식별 도움이 됩니다. 그것은 음 핵 산 FFPE 직물에서 발견 한 심각한 물리적 손상과 그들의 분석을 어렵게 하 고 일반적으로 적응된 분석 실험을 요구 한다 화학 수정 받은 설명 하고있다. 그러나 MicroRNAs (miRNAs),, 소규모 클래스를 대표 하는 RNA 분자 ~ 18-24만 까지의 스패닝의 뉴클레오티드, 장기 저장을 견딜 하는 FFPE 샘플에서 성공적으로 분석 된 표시 되었습니다. 여기에서 우리는 3′ 바코드 보완 DNA (cDNA) 라이브러리 준비 프로토콜 때 보관 사용 하 여 강력 하 고 매우 재현 될 최근 시연 했다 보관 된 조직에서 추출 하는 작은 RNAs의 분석을 위해 특별히 최적화 된 선물 임상 표본 최대 35 년 저장입니다. 이 라이브러리 준비는 소재의 손상/저하 (최대 18) RNA 샘플 개별 3′ 바코드 어댑터와 출혈 하 고 후속 효소 및 생 화 확 적인 준비에 대 한 다음 함께 풀링된 다중 분석을 잘 적응 이전에 분석. 모든 담긴 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지), 크기 관련 선택 및 바코드 작은 RNA 종의 풍부는에 의해 수행 됩니다. 이 cDNA 라이브러리 준비는 파일럿 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 차세대 시퀀싱 (NGS)에 대 한 자료의 최적의 금액을 생산 하는 특정 증폭 주기의 결정 수 분 RNA 입력에 잘 적응. 이 이렇게 최대 35 년 동안 보관 하는 표본에서 저하 FFPE RNA의 사용을 위해 최적화 되었다 고 매우 재현 NGS 데이터를 제공 합니다.
Introduction
miRNAs는 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 표본1,2,3에 너무나 잘 보존 된다. 이러한 짧은 규제 비 코딩 단일 좌초 RNA 분자의 표현을 FFPE 샘플에서 총 RNA를 사용 하 여 성공적으로 평가할 수 있다 고 관련 유전자 표현 데이터 원본 신선한에 비해 제공 이전 작품 시연 하고있다 조직4,,56,7,8. 비판적으로 FFPE 조직 처리 (포름알데히드, 열, 건조, 등), 내 생 RNases miRNAs (~ 18-24의 작은 크기는 견본의 나이 의해 영향을 받을 수 표시 된 큰 크기 메신저 RNAs에 비교 될 때 뉴클레오티드) 저하 방지 및 장기 저장, 보관 된 표본9의 높은 처리량 mRNA 연구를 능가할 미르 식 연구를 통해 증명 또한 탄력 있도록 나타납니다. miRNA 식 연구 주로 소규모 분석에서 수행 되었습니다, 보관 된 임상 견본을 사용 하 여 해당 단일 증명 또는 다중화 정량 PCR 분석 실험, microarray 기술, 그리고 가장 최근 NGS의 종류 수 있습니다. 이 분석 실험10,,1112,,1314의 최적화 후 보존 된 miRNAs의 식을 평가 하기 위해 사용.
그것은 명백한 되고있다 dysregulation 미르 식의 다양 한 인간 악성의 개발과 관련 된 되었습니다 하 고 보관 된 표본 주석는 잠재적으로 거 대 한 공급의 임상,을이 작은 RNA 분자는 잠재적인 암 바이오 마커의15,16,,1718의 유망한 소스를 나타냅니다. NGS 같은 높은 처리량 유전자 표현 기술의 사용 PCR 그리고/또한 microarrays19등 대상된 기술에 비교 될 때 모든 miRNA 성적표의 글로벌 평가 제공의 이점이 있다. 이러한 이유로, NGS 위한 이전 보관 된 표본에서 작은 RNAs의 cDNA 라이브러리 준비를 위한 최적화 된, 저렴 한 가격, 그리고 쉽게 적용 가능한 프로토콜 대규모 회고전 연구20수 있도록 최적화 되었다.
우리는 이전 우리 현대 상업 키트21을 능가할 수 있는 오래 된 보관 된 표본에서 RNA와 DNA의 별도 복구에 대 한 동시 RNA/DNA 추출 프로토콜을 설립. 시간의 연장된 기간 동안 보관 하는 FFPE 직물에서 총 RNA를이 추출 프로토콜을 사용 하 여, 우리 최대 35 년 동안 임상 표본에서 보존 하는 miRNAs의 NGS 위한 cDNA 라이브러리의 준비를 최적화. 또한, 최근에 출판 된 연구에서 우리가 어디에서 임상 분류 ductal 암에 제자리에 cDNA 라이브러리 (DCIS) 표본 준비, 우리는 표시 된 정량 PCR에 의해 검증 된 차동 표현 된 miRNAs 확인 그 특정 miRNA 표정 변화 DCIS 유방암을 개발 하지 않는 환자에서 DCIS 장애에 비해 유방암에 걸린 환자에서 병 변에서 감지 될 수 있습니다.
고려 상업 키트 작은 RNA cDNA 라이브러리의 준비를 위해, 그들의 중지에 대 한 잠재력의 비용으로 최적화할 수 없습니다 저작권/특허 보호 시 약의 사용, 우리는 이전 게시 된 적응 하기로 실험실 및 키트 무료 3′ 바코드 cDNA 라이브러리 준비 위한 프로토콜 FFPE 표본에서 보관 하는 작은 RNAs의 NGS,22를샘플링 18의 동시 분석을 허용 합니다. 이 프로토콜 FFPE RNA 견본에 적응에 대 한 중요 했다, 시각 및 기술 평가 검문소와 이상적이 고 강력한 단계별 절차를 제공 하 고 손상 된 또는 어려운 다른 소스를 응용 프로그램에 대 한 강한 잠재력을가지고 이용 하 여 RNA 소재. 원래 프로토콜의 적용 형광 (예를 들어, SYBR 골드)와 방사성 레이블된 크기 마커를 대체 하 여 향상 되었습니다 감지 RNA 크기 마커 큰 polyacrylamide 젤에 합자 라이브러리의 선택 사용. 3′ 18 개별 FFPE RNA 견본을에 바코드 어댑터의 결 찰 의존이 최적화 된 프로토콜 다음 5′ 어댑터 결 찰을 함께 풀링된 리버스-전사, 그리고 파일럿 PCR 분석에 대 한 맞춤형 최종 cDNA의 증폭 높은 처리량 시퀀서에 대규모 PCR 증폭, 정화, 그리고 NGS 이전 도서관.
Protocol
Representative Results
Discussion
NGS FFPE RNA 표본에서 보관 하는 작은 RNAs의에 대 한 높은 재현성 및 강력한 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜 Hafner 외. 에 의해 설명 하는 절차의 수정 하 고 최적화 된 버전은이 프로토콜에서 제공 됩니다. 22
이 프로토콜의 모든 단계는 FFPE 표본에서 발견 이전 보관 및 손상 된 총 RNA와 함께 사용 하기 위해 최적화 되었습니다. 이 프로토콜 FFPE RNA의 적은 양?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 박사 토마스 Tuschl, RNA 분자 생물학 실험실의 머리 뿐만 아니라 그들의 지원에 대 한와 그의 실험실에 RNAworld 파이프라인에 대 한 액세스를 제공 하는 개발 된 기술을 공유 하기 위한 그의 실험실의 구성원 감사. 우리는 또한 그의 프로토콜을 공유 하 고 그의 초기 절차에 사용 된 모든 생화학 및 효소 단계에 자세한 설명을 제공 하 박사 마르쿠스 Hafner 감사 합니다.
Materials
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | Ambion | AM8110G | |
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt ladder | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20mg/ml Bovine Serum Albumine | Sigma | B8894-5ML | |
| 50X Titanium Taq | Clontech Laboratories | 639208 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | 7727-54-0 | |
| BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs | GIBCO | V16 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D9170-5VL | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424R | USA scientific | 4054-4537Q | |
| Eppndorf Thermomixer | USA scientific | 4053-8223Q | |
| Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Gel Breaker Tube 0.5 ml | IST Engineering Inc, | 3388-100 | |
| Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| Jersey-Cote | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | Ambion | AM9640G | |
| MgCl2 1M | Ambion | AM9530G | |
| Minifuge dual rotor personal centrifuge | USA scientific | 2641-0016 | |
| Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers | Ciore Life Science | 21070010 | |
| Oligonucleotides | IDT | Defined during order | |
| Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs | Thermofisher Scientific | B2 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Restriction enzyme PmeI | NEB | R0560S | |
| RNase-free water | Ambion | AM9932 | |
| Safe Imager 2.0 | Life Technologies | G6600 | |
| Safe Imager 2.0 blue light transilluminator | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE agarose | Lonza | 50002 | |
| Superscript III reverse transcription kit | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| Themocycler with heated lid | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer | National Diagnostics | EC-833 |
Riferimenti
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