Dieses Protokoll zeigt ein sicheres und effizientes Verfahren zur CD133 ändern+ Hämatopoetischen Stammzellen. Der vorgestellte nicht-viralen, magnetische Polyplex basierenden Ansatz kann eine Grundlage für die Optimierung der therapeutischen Stammzellen Effekte sowie für die Überwachung der verabreichten Zelle Produkt per Magnet-Resonanz-Tomographie bilden.
Während CD133+ Hämatopoetischen Stammzellen (SCs) erwiesen sich als um hohes Potenzial auf dem Gebiet der regenerativen Medizin zu bieten, ihre geringe Abscheideraten nach Injektion in das verletzte Gewebe sowie die massive beobachtete Sterbeziffern führen zu sehr eingeschränkten therapeutischen Wirkungen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir versucht, ein nicht-viralen basierte Protokoll für geeignete Zelle Engineering vor ihrer Verwaltung zu etablieren. Die Änderung der menschlichen CD133+ mit dem Ausdruck SCs mit magnetischen Polyplexes MicroRNA (MiR) geladen richtete sich in Bezug auf die Aufnahme-Effizienz und Sicherheit sowie das targeting Potential der Zellen. Unter Berufung auf unserem Protokoll, erreichen wir hohe MiR Inanspruchnahme von 80 – 90 %, während die CD133+ Stammzelle Eigenschaften bleiben unberührt. Darüber hinaus bieten diese veränderten Zellen die Möglichkeit der magnetischen Ausrichtung. Wir beschreiben hier ein sicheres und hoch effiziente Verfahren für die Änderung von CD133+ SCs. Wir erwarten, dass dieser Ansatz zu eine Standardtechnologie zur Optimierung der therapeutischen Stammzellen Effekte sowie für die Überwachung des Messguts verabreichten Zelle per Magnetresonanztomographie (MRT) zur Verfügung zu stellen.
CD133+ SCs repräsentieren eine heterogene Zellpopulation Stamm- und Vorläuferzellen mit vielversprechenden Potential für die regenerative Medizin. Ihre myogen hämatopoetischen und endothelialen Differenzierung möglicher1,2,3 ermöglicht die CD133+ Zellen, z. B., Beitrag zur Neovaskularisation Prozesse durch eine Differenzierung in Schiffen und Aktivierung der Pro-angiogenen Signalisierung durch Parakrine Mechanismen4,5,6,7neu bilden.
Trotz ihres hohen Potenzials in mehr als 30 genehmigten klinischen Studien (ClinicalTrails.gov) gezeigt ist ihre therapeutische Ergebnis noch unter kontroverse Diskussion4. In der Tat wird eine klinische Anwendung der SCs durch niedrige Retention in der Orgel von Zinsen und massive erste Zelle Tod5,8,9behindert. Weitere engineering von CD133 könnte helfen, diese Herausforderungen zu meistern+ SCs vor Transplantation.
Eine Voraussetzung für eine effiziente Zelltherapie wäre die Reduktion von den massiven erste Zelltod, das Engraftment therapeutisch relevanten Zellen10zu verbessern. Aktuelle Studien zeigten eine immense Zellverlust von 90-99 % in höchst PERFUNDIERTEN Organen wie Gehirn und Herz während der ersten 1 – 2 Std., unabhängig von der Art der transplantierten Zellen oder Anwendung route11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC Kennzeichnung mit magnetischen Nanopartikeln (MNPs) ermöglicht eine innovative nicht-invasive Strategie an Zielzellen auf der Website von Interesse22,23,24,25,26 und gleichzeitig ermöglicht die Handy Überwachung mittels MRI27 und magnetic Particle imaging (MPI). Die effizienteste in Vivo Studien Anwendung magnetisierten Zelle gezielt verwendete Zelle Aufbewahrung nach der lokalen Verabreichung bevorzugt Zelle Führung nach intravenöser Injektion23,24,28 . Daher entwickelt unsere Gruppe ein Delivery-System bestehend aus superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln29. Mit dieser Technik, CD133+ SCs und menschlichen nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) effizient ausgerichtet sein könnte, wie durch in-vitro- Versuche30,31.
Eine weitere Hürde für SC-Therapien ist die feindlichen entzündlichen Umgebung des betroffenen Gewebes nach der Transplantation, die auf die erste Zelle Tod32beiträgt. Neben mehreren Vorkonditionierung Studien war die Anwendung der therapeutischen relevanten MiRs getesteten33; Es wurde erfolgreich nachgewiesen, dass Anti-apoptotische MiRs Apoptose in Vitro hemmen und Zelle Engraftment in Vivo33verbessern. Diese kleinen Moleküle, bestehend aus 20 – 25 Nukleotide, spielen eine entscheidende Rolle als posttranskritionelle Modulatoren der Messenger-RNAs (mRNAs) und beeinträchtigen somit Stammzellen Schicksal und Verhalten34. Darüber hinaus die exogene Einführung MiRs vermeiden unerwünschte stabile Integration in die Host-Genom-34.
Aktuelle Versuche zur effizienten Einführung von Nukleinsäuren (NAs) in primäre SCs basieren meist auf rekombinante Viren8,35. Trotz der hohen Transfektion Effizienz stellt rekombinanten Virus Manipulation ein großes Hindernis für eine Bank-zu-Bett-Übersetzung, z.B.unkontrollierbare Genexpression, Pathogenität, Immunogenität und insertional Mutagenese35 ,36. Nicht-viralen-Delivery-Systeme wie Polymer-basierten Konstrukte sind daher kritisch zu entwickeln. Unter denen Polyethylenimine (PEI) stellt eine gültige Lieferfahrzeug bietet Vorteile für MiRs wie NA Kondensation zum Schutz vor Abbau, zelluläre Aufnahme und intrazellulären Freigabe durch Endosomal entgehen37,38. Darüber hinaus zeigte MiR-PEI-komplexe eine hohe Biokompatibilität in klinischen Studien39. Unser Liefersystem besteht also aus einem biotinylierte verzweigten 25 kDa PEI gebunden zu einem Streptavidin beschichteten MNP-Kern30,31,40.
In diesem Manuskript präsentieren wir ein umfassendes Protokoll beschreiben (i) die manuelle Isolierung von CD133+ SC aus menschlichen Knochenmark (BM) Spende mit einer ausführlichen Charakterisierung von SC Produkt- und (Ii) ein effizientes und schonendes Transfektion von einem magnetisch nicht-viralen Polymer-basierten Liefersystem für gentechnische Veränderung von CD133+ SCs mit MiRs. CD133+ SCs sind isoliert und magnetisch aus menschlichen sternale BM Aspiraten mit einer Oberfläche Antikörper-basierten magnetisch aktivierte Zelle Sortieranlage (MACS) angereichert. Danach sind die Zellviabilität sowie die Zelle Reinheit mit Durchflusszytometrie analysiert. Folge MiR/PEI/MNP-komplexe sind vorbereitet und CD133+ SCs sind transfiziert. 18 h nach Transfektion, die Aufnahme-Effizienz und die Auswirkungen der Transfektion auf SC Marker Ausdruck und Zelle überleben werden analysiert. Darüber hinaus erfolgt Bewertung der intrazelluläre Verteilung der Transfektion komplexer Verbindungen mit vierfarbigen Kennzeichnung und strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM).
In den letzten Jahren, CD133+ SCs entstanden als eine viel versprechende Zellpopulation für SC-basierte Therapien wie von mehreren phase I, II und III klinischen Studien43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 …
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung Deutschland (FKZ 0312138A und FKZ 316159), der staatlichen Mecklenburg-Vorpommern mit EU-Strukturfonds (ESF/IVWM-B34-0030/10 und ESF/IVBM-B35-0010/12) und der DFG (DA1296/2-1), die Deutsche Herzstiftung (F/01/12), das BMBF (VIP + 00240) und der FEUCHTEN Foundation. Darüber hinaus werden f.h. und Uhr durch das FORUN-Programm von Rostock University Medical Center (889001) unterstützt.
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | 3% |
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-853 | |
anti-CD34-FITC (clone: AC136) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-081-001 | |
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) | BD Biosciences | 560178 | |
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
BSA | Sigma-Aldrich GmbH | A7906 | |
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-049 | |
collagenase B | Roche Diagnostics GmbH | 11088831001 | |
counting chamber | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | ||
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Ambion | AM17120 | |
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 10104159001 | (100 U/mL) |
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-059-901 | |
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | O10241 | |
aqueous mounting medium; Fluoroshield | Sigma-Aldrich GmbH | F6182 | |
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 89048-932 | |
MACS magnet holder; MACS MultiStand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
MACS pre-separation filter | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | 30 µm |
MACS separation column (MS / LS) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-201 / 130-042-401 | |
MACS permanent magnet; MACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-302 | |
Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45 μm |
mouse IgG 2b-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-215 | |
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
human lymphocyte separating medium; Pancoll | Pan Biotech GmbH | P04-60500 | density: 1.077 g/mL |
PBS | Pan Biotech GmbH | P04-53500 | without Ca and Mg |
PEI | Sigma-Aldrich GmbH | 408727 | branched; 25 kDa |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 μg/mL |
PFA | Merck Schuchardt OHG | 1040051000 | |
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Ambion | AM17110 | |
RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
RNAse decontamination solution; RNaseZap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Pan Biotech GmbH | P04-16500 | |
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 | Stemcell Technologies | 2690 | |
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 | Stemcell Technologies | 9800 | |
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega Corporation | Z5481 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich GmbH | T8154 | 0.4 % |
UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | 0.5 M; pH 8.0 |
ZEN2011 software | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath | Bandelin electronic | Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz |