Protokoll för mikroRNA överföring till benmärgen-härrör hematopoetiska stamceller att aktivera Cell teknik kombinerat med magnetiska inriktning

Summary

Detta protokoll illustrerar ett säkert och effektivt förfarande för att ändra CD133⁺ hematopoetiska stamceller. Den presenterade icke-virala, magnetiska polyplex synsätt kan utgöra grund för optimering av terapeutiska stamceller effekter samt för övervakning av administrerade cell produkten via magnetisk resonanstomografi.

Abstract

Medan CD133⁺ hematopoetiska stamceller (SCs) har visat sig ge hög potential inom regenerativ medicin, deras låga retentionsfrekvenserna efter injektion i skadade vävnader samt de observerade massiva cell dödstalen leda till mycket begränsade terapeutiska effekter. För att övervinna dessa begränsningar, försökte vi upprätta en icke-virala baserat protokoll för lämplig cell engineering före deras administration. Modifiering av mänskliga CD133⁺ uttrycker SCs använder mikroRNA (miR) laddade magnetiska polyplexes togs upp avseende upptag effektivitet och säkerhet samt inriktning potentialen i cellerna. Förlitar sig på våra protokoll, kan vi uppnå hög miR upptag priser på 80 – 90% medan CD133⁺ stamceller egenskaper påverkas. Dessutom erbjuder dessa modifierade celler alternativet av magnetiska inriktning. Vi beskriver här en säker och mycket effektiv förfarandet för ändring av CD133⁺ SCs. Vi förväntar oss detta tillvägagångssätt ger en standardteknik för optimering av terapeutiska stamceller effekter och för övervakning av administrerade cell produkten via magnetisk resonanstomografi (MRT).

Introduction

CD133⁺ SCs utgör en heterogen stammen och progenitor cell befolkning med lovande potential för regenerativ medicin. Deras hematopoetiska, endotel och myogenic differentiering potentiella^1,2,3 gör CD133⁺ celler, t.ex., att bidra till kärlnybildning processer genom differentiering till nyligen bildar fartyg och aktivering av proangiogena signalering av parakrin mekanismer^4,5,6,7.

Trots deras hög potential som visats i mer än 30 godkända kliniska studier (ClinicalTrails.gov), pågår deras terapeutiska resultat fortfarande kontroversiell diskussion⁴. Faktiskt hämmas en klinisk tillämpning av SCs av låg retention i organ av intresse och massiva första cell death^5,8,9. Ytterligare konstruktion av CD133⁺ SCs tidigare transplantation kunde hjälpa övervinna dessa utmaningar.

En förutsättning för en effektiv cellterapi skulle vara en minskning av den massiva första celldöd att förbättra engraftment av terapeutiska relevanta celler¹⁰. Aktuella studier har visat en enorm cellförlust 90 – 99% i högt perfunderade organ som hjärnan och hjärtat under de första 1 – 2 h, oberoende av vilken transplanterade celler eller programmet route^{11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21}. SC märkning använder magnetiska nanopartiklar (MNPs) möjliggör en innovativ icke-invasiv strategi till målcellerna till platsen av intresse^{22,23,24,25,26} och samtidigt tillåter cell övervakning med hjälp av MRI²⁷ och magnetiska partikel imaging (MPI). Den mest effektiva i vivo studier tillämpa magnetiserade cell inriktning använda cellen retention efter lokal administrering stället cellen vägledning efter intravenös injektion^23,24,28 . Därför utformat vår grupp ett system bestående av superparamagnetiska järnoxid nanopartiklar²⁹. Med denna teknik, CD133⁺ SCs och mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs) kunde effektivt riktas, vilket framgår av in vitro- försök^30,31.

Ett annat hinder för SC terapier är den ogästvänliga inflammatoriska miljön i den drabbade vävnaden efter transplantation, vilket bidrar till den första cell död³². Förutom flera förkonditioneringen studier var tillämpningen av terapeutiskt relevant miRs testade³³; Det har varit framgångsrikt visat att anti-apoptotiska miRs hämmar apoptos i vitro och förbättra cell engraftment i vivo³³. Dessa små molekyler, som består av 20 – 25 nukleotider, spela en avgörande roll som postttransskriptionell modulatorer av messenger RNA (mRNA), och därmed påverka stamceller öde och beteende³⁴. Dessutom exogena införandet av miRs undvika oönskad stabil integrering i den mottagande genom³⁴.

Nuvarande försök för effektiv införandet av nukleinsyror (NAs) i primära SCs är mestadels baserade på rekombinanta virus^8,35. Trots den höga transfection effektiviteten presenterar rekombinanta virus manipulation ett stort hinder för en bänk-till-sängbord översättning, t.ex., okontrollerbara genuttryck, patogenicitet, immunogenicitet och insertionsmutationer^{35 ,36}. Icke-virala leverans system såsom polymerbaserade konstruktioner är därför viktiga att utveckla. Bland dem, polyethylenimine (PEI) representerar en giltig leveransfordon som erbjuder fördelar för miRs såsom NA kondens att skydda från nedbrytning, cellernas upptag, och intracellulära utsläpp via endosomal fly^37,38. Dessutom visat miR-PEI komplex en hög biokompatibilitet i kliniska prövningar³⁹. Vårt leveranssystem består därför av en biotinylerade Grenade 25 kDa PEI bunden till en streptividin-belagda MNP-core^30,31,40.

I detta manuskript, presenterar vi ett omfattande protokoll som beskriver de manuella isoleringen av CD133⁺ SC från human benmärg (BM) donation med en detaljerad karakterisering av SC produkten och (ii) en effektiv och skonsam transfection strategi för en magnetiskt icke-virala polymerbaserade leveranssystem för genteknik av CD133⁺ SCs använder miRs. CD133⁺ SCs har isolerats och magnetiskt berikad från mänskliga sternala BM enkelarmade använder en surface antikroppsbaserade magnetiska-aktiverad cell sortering (Mac) system. Efteråt, cellviabiliteten samt cell renhet analyseras med flödescytometri. Därefter miR/PEI/MNP komplex är beredda och CD133⁺ SCs är transfekterade. 18 h efter transfection, upptag effektivitet och inverkan av transfection på SC markör uttryck och cell lönsamhet analyseras. Vidare utförs utvärdering av intracellulära fördelningen av de transfection komplexa föreningarna med fyrfärg märkning och strukturerade belysningen mikroskopi (SIM).

Protocol

Sternala mänskliga BM för cell isolering erhölls från informerat donatorer, som gav sitt skriftliga samtycke till att använda sina prover för forskning enligt Helsingforsdeklarationen. Den etiska kommittén av det Universitetar av Rostock har godkänt presenterade studien (reg. nr A 2010 23, långvarig under 2015). 1. cell förberedelse Obs: Använda heparin natrium (250 IU/mL BM) för att förhindra koagulering för BM undersökning. CD133<s…

Representative Results

Presenterade protokollet beskriver en manuell isolering och magnetisk anrikning av mänskliga BM-derived CD133+ SCs med en efterföljande virus oberoende cell teknik strategi, som en icke-invasiv teknik för in vitro- cell manipulation och i vivo övervakningsverktyg. Denna tre-stegs isolering teknik tillåter en separation av multinationella företag från den pre sammandrag sternala BM genom täthe…

Discussion

Under de senaste åren, CD133⁺ SCs har dykt upp som en lovande cell befolkningen för SC-baserade terapier vilket framgår av flera fas I, II och III kliniska prövningar^{43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 …}

Materials

7-AAD	BD Biosciences	559925
Acetic Acid with Methylene Blue	Stemcell Technologies	7060	3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3)	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136)	Miltenyi Biotec GmbH	130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1)	BD Biosciences	560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin	ATTO-TEC GmbH	AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer	BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2	BD Biosciences
BSA	Sigma-Aldrich GmbH	A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit	Miltenyi Biotec GmbH	130-097-049
collagenase B	Roche Diagnostics GmbH	11088831001
counting chamber	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1	Ambion	AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit	Mirus Bio	MIR 9650
DNAse I	Roche Diagnostics GmbH	10104159001	(100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope	Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec GmbH	130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit	Thermo Fisher Scientific	O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield	Sigma-Aldrich GmbH	F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube	Greiner Bio-One	89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-303
MACS pre-separation filter	Miltenyi Biotec GmbH	130-041-407	30 µm
MACS separation column (MS / LS)	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-302
Millex-HV PVDF Filter	Merck	SLHV013SL	0.45 μm
mouse IgG 2b-PE	Miltenyi Biotec GmbH	130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll	Pan Biotech GmbH	P04-60500	density: 1.077 g/mL
PBS	Pan Biotech GmbH	P04-53500	without Ca and Mg
PEI	Sigma-Aldrich GmbH	408727	branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 U/mL, 100 μg/mL
PFA	Merck Schuchardt OHG	1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1	Ambion	AM17110
RBC lysis buffer	eBioscience	00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap	Thermo Fisher Scientific	AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Pan Biotech GmbH	P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100	Stemcell Technologies	2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000	Stemcell Technologies	9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles	Promega Corporation	Z5481
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich GmbH	T8154	0.4 %
UltraPure EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software	Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath	Bandelin electronic		Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz