हम विभाजन-BioID, एक प्रोटीन टुकड़े-पूरक परख निकटता लेबलिंग तकनीक BioID के आधार पर के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । दो दिया प्रोटीन की बातचीत पर सक्रिय, यह अपने देशी सेलुलर वातावरण में संदर्भ निर्भर प्रोटीन परिसरों के प्रोटियोमिक् विश्लेषण की अनुमति देता है । विधि सरल, लागत प्रभावी है और केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है ।
प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) की पहचान के लिए मौजूदा संबध शुद्धिकरण (AP) दृष्टिकोणों को पूरक करने के लिए, एंजाइमों का परिचय दिया गया है जो जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन की निकटता पर निर्भर लेबलिंग की अनुमति देते हैं । एक ऐसा एंजाइम, बिरा * (BioID दृष्टिकोण में प्रयुक्त), लगभग 10 एनएम की एक सीमा के भीतर प्रोटीन की biotinylation मध्यस्थता । इसलिए, जब ब्याज की एक प्रोटीन से जुड़े और कोशिकाओं में व्यक्त की, यह अपने पैतृक वातावरण में समीपस्थ प्रोटीन के लेबल की अनुमति देता है । एपी के विरोध के रूप में है कि इकट्ठे प्रोटीन परिसरों की शुद्धि पर निर्भर करता है, BioID का पता लगाता है प्रोटीन है कि कोशिकाओं के भीतर चिह्नित किया गया है कोई फर्क नहीं पड़ता कि वे अभी भी ब्याज के प्रोटीन के साथ बातचीत कर रहे है जब वे अलग कर रहे हैं । यह समीपस्थ प्रोटीन biotinylates के बाद से, एक इसके अलावा बहुत कुशलता से उन्हें अलग करने के लिए बायोटिन के लिए streptavidin के असाधारण संबंध पर कैपिटल कर सकते हैं । जबकि BioID क्षणिक या कमजोर बातचीत की पहचान के लिए एपी से बेहतर प्रदर्शन, दोनों एपी और BioID-मास स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण हर संभव बातचीत एक दिया प्रोटीन हो सकता है की एक सिंहावलोकन प्रदान करते हैं । हालांकि, वे प्रत्येक पहचान पीपीआई के संदर्भ में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं । दरअसल, ज्यादातर प्रोटीन आमतौर पर कई परिसरों का हिस्सा हैं, अलग परिपक्वता कदम या विभिंन कार्यात्मक इकाइयों के लिए इसी । दोनों तरीकों की इस आम सीमा का पता है, हम एक प्रोटीन-टुकड़े पूरक परख बिरा * एंजाइम के आधार पर इंजीनियर है । इस परख में, बिरा के दो निष्क्रिय टुकड़े * एक सक्रिय एंजाइम में फिर से इकट्ठा कर सकते है जब दो बातचीत प्रोटीन जो वे जुड़े हुए है द्वारा करीब निकटता में लाया । जिसके परिणामस्वरूप विभाजन-BioID परख इस प्रकार प्रोटीन का लेबल है कि चारों ओर बातचीत प्रोटीन की एक जोड़ी इकट्ठा अनुमति देता है । बशर्ते इन दोनों केवल एक दिए गए संदर्भ में बातचीत, विभाजन-BioID तो उनके देशी सेलुलर वातावरण में विशिष्ट संदर्भ पर निर्भर कार्यात्मक इकाइयों के विश्लेषण की अनुमति देता है । यहाँ, हम परीक्षण करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और एक जोड़ी प्रोटीन बातचीत करने के लिए विभाजन BioID लागू.
के रूप में सबसे सेलुलर कार्यों प्रोटीन है कि गतिशील macromolecular परिसरों को इकट्ठा द्वारा प्रदर्शन कर रहे हैं, प्रोटीन की पहचान-प्रोटीन बातचीत (पीपीआई) जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक प्रमुख प्रयास है । दरअसल, पीपीआई अक्सर रोग में विनियमित रहे है और चिकित्सकीय के लिए संभावित लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व1। पीपीआई की पहचान के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि समानता शुद्धि (एपी) दृष्टिकोण है, जिसमें सेल lysis, ब्याज की एक प्रोटीन विशेष रूप से एक मैट्रिक्स पर शुद्ध है और संबंधित प्रोटीन बाद में जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान की है (MS) । जबकि एपी एमएस एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है, यह आमतौर पर खराब घुलनशील प्रोटीन परिसरों, बहुत क्षणिक बातचीत या पीपीआई कि एक बरकरार सेलुलर संरचना की आवश्यकता पर अच्छी तरह से प्रदर्शन नहीं करता है । इसके अलावा, डेटा की व्याख्या पीपीआई नेटवर्क के गतिशील स्वभाव से जटिल हो सकती है, क्योंकि एक भी प्रोटीन अक्सर कई विशिष्ट प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का हिस्सा होता है ।
निकटता-लेबलिंग तकनीक जैसे BioID2 या APEX23,4 हाल ही में एपी एमएस दृष्टिकोण की सीमाओं में से कुछ को संबोधित करने के लिए विकसित किए गए । BioID में, एंजाइम बिरा * (जंगली प्रकार ई. कोलाई एंजाइम के एक G115R संस्करण के लिए इसी) labile biotinyl के गठन catalyzes-amp (जैव amp) कि प्राथमिक अमीन के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं. के रूप में जंगली प्रकार एंजाइम का विरोध किया, कि अपने सक्रिय केंद्र में जैव amp बरकरार रखती है, बिरा * अपने पड़ोसी वातावरण के लिए इसके प्रसार की अनुमति जैव amp विज्ञप्ति. इसलिए, जब ब्याज की एक प्रोटीन से जुड़े हुए और कोशिकाओं में व्यक्त की है, समीपस्थ प्रोटीन 10 एनएम के एक अनुमानित सीमा के भीतर biotinylated जा सकता है5। इन चिह्नित समीपस्थ प्रोटीन तो streptavidin pulldown द्वारा पृथक कर रहे है और एमएस द्वारा की पहचान की । एपी-एमएस के विरोध के रूप में, BioID एक फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति की आवश्यकता है । यह इस प्रकार केवल जिसका समारोह टैगिंग से बाधा नहीं है प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, लेबलिंग की गति धीमी है, आमतौर पर 6-24 ज2,6, कम रहते थे चुनौतीपूर्ण प्रोटीन का पता लगाने । फिर भी, एपी की तुलना में, एमएस, BioID-ms कई प्रमुख लाभ प्रदान करता है: पहले, अपनी अपनी देशी सेलुलर पर्यावरण में बातचीत कब्जा; दूसरा, लेबल प्रोटीन के बजाय इकट्ठे परिसरों कोशिका lysis के बाद अलग कर रहे हैं; तीसरा, streptavidin pulldowns denaturing बफ़र्स और कठोर धोने की स्थिति का उपयोग कर अनुमति देते हैं । इसलिए, विधि क्षणिक या कमजोर बातचीत का पता लगाने के लिए अधिक संवेदनशील है7 या बातचीत है कि एक विशिष्ट और सेलुलर संरचना को अलग करने के लिए कठिन पर होते है8।
हालांकि, सबसे प्रोटीन आम तौर पर बड़े परिसरों का हिस्सा है कि सेलुलर cues या समारोह की जरूरत है कि प्रदर्शन करने के लिए के अनुसार remodel कर सकते हैं । इसलिए, एक एकल प्रोटीन आम तौर पर कई परिसरों का हिस्सा है, विशिष्ट कार्यात्मक इकाइयों के लिए इसी, अलग शामिल है और/ दोनों दृष्टिकोण सभी संघों एक दिया प्रोटीन हो सकता है की एक सिंहावलोकन दे, लेकिन वे व्यक्तिगत पीपीआई के संदर्भ को संबोधित करने में विफल । बाद के संकल्प को बढ़ाने के लिए, हम एक प्रोटीन-टुकड़े पूरक परख (पीसीए) डिजाइन किया है जिसमें बिरा * (NBirA *, कि उत्प्रेरक डोमेन शामिल है, और CBirA * कि पुनः के रूप में देखा जा सकता है के दो निष्क्रिय टुकड़े-सक्रियकरण डोमेन) एक सक्रिय एंजाइम में फिर से इकट्ठा जब दो बातचीत प्रोटीन9से करीब निकटता में लाया । जिसके परिणामस्वरूप विभाजन-BioID परख प्रोटीन पर निकटता-निर्भर biotinylation है कि एक जोड़ी के आसपास इकट्ठा प्रोटीन पर केंद्रित है और इस तरह संदर्भ निर्भर प्रोटीन विधानसभाओं की पहचान की अनुमति देता है । हम हाल ही में दो अलग प्रोटीन miRNA में शामिल परिसरों-मध्यस्थता जीन-मुंह बंद करनेमार्ग9 को हल करके विभाजित-BioID के बकाया संकल्प शक्ति का प्रदर्शन किया ।
कुल मिलाकर, एक एकल और सरल परख, विभाजन BioID की खोज और विशेष रूप से पीपीआई निर्दिष्ट करने के लिए परिभाषित कार्यात्मक इकाइयों जिसमें एक दिया प्रोटीन शामिल है की अनुमति देता है, एक अतिरिक्त इसी प्रोटीन परिसर के प्रोटीन बातचीत में जाना जाता है प्रदान की ।
उल्लिखित प्रक्रिया का वर्णन कैसे विभाजन में ब्याज की जीन क्लोन करने के लिए-BioID plasmids, कैसे संपर्क के लिए परीक्षण के लिए प्रेरित biotinylation और कैसे biotinylated प्रोटीन को अलग करने के लिए जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए । हम यहां एक क्षणिक अभिकर्मक के आधार पर प्रक्रिया का वर्णन । जबकि फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति मध्यम करने के लिए जोड़ा dox की राशि से देखते किया जा सकता है, परिवर्तनीय अभिकर्मक कुछ कोशिकाओं है कि मोटे तौर पर फ्यूजन प्रोटीन जब अंतर्जात की तुलना में व्यक्त के साथ गैर समरूप प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं समकक्षों. यह इसी interactomes की विकृतियों और पीपीआई के लिए नेतृत्व कर सकते है कि ईमानदारी से बातचीत है कि अंतर्जात प्रोटीन शामिल प्रतिबिंबित नहीं करते । यह आमतौर पर स्थिर सेल लाइनों का निर्माण एक बार विभाजन-BioID क्षणिक प्रणाली के साथ स्थापित किया गया है सलाह दी जाती है । plasmids Flp-मध्यस्थता पुनर्संयोजन प्रणाली के साथ संगत कर रहे हैं और एक ही tet उत्तरदायी तत्व के विनियमन के तहत ब्याज की दोनों जीन जगह. यदि आवश्यक हो, और जब संगत स्तनधारी कोशिकाओं के साथ प्रयोग किया जाता है, वे स्थिर inducible सेल लाइनों के आसान निर्माण की अनुमति देते हैं । उदाहरण के लिए, हम हेला-EM2-11 लाइन है कि rtTA टेट्रासाइक्लिन-प्रतिलेखन उत्प्रेरक और एक अद्वितीय लक्षित जीनोमिक लोकस है जो टेट्रासाइक्लिन से मध्यस्थता जीन अभिव्यक्ति कसकर12विनियमित किया जा सकता है व्यक्त का उपयोग करें । इस कक्ष पंक्ति और Flp-मध्यस्थ पुनर्संयोजन का उपयोग करते हुए, transgene की केवल एक प्रति वाली स्थिर कक्ष रेखाओं को दो-तीन सप्ताह के भीतर प्राप्त किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, एक भी वर्तमान जीनोम संपादन तकनीक का उपयोग करने के लिए ब्याज की जीन के मूल जीनोमिक loci में बिरा * टुकड़े शुरू कर सकता है ।
के रूप में किसी भी परख कि एक प्रोटीन टैगिंग पर निर्भर करता है, एक पर विचार अगर जिसके परिणामस्वरूप फ्यूजन प्रोटीन कार्यात्मक है की जरूरत है । उपलब्ध डेटा जिसमें ब्याज के प्रोटीन (इमेजिंग अध्ययन के लिए GFP के साथ उदाहरण के लिए) टैग किए गए थे और कार्यात्मक परीक्षण के लिए तय अगर बिरा * टुकड़े ऊपर या बहाव के नीचे क्लोन किया जाना चाहिए उपयोगी है ब्याज की जीन । यदि कोई ऐसा डेटा उपलब्ध हैं, एक परीक्षण करना चाहिए N-टर्मिनली या सी-टर्मिनली एक कार्यात्मक परख में प्रोटीन टैग । उदाहरण के लिए, फ्यूजन प्रोटीन की गतिविधि एक सेल लाइन जिसमें अंतर्जात प्रोटीन खटखटाया गया है और जंगली प्रकार की स्थिति की तुलना में परीक्षण किया जा सकता है । यदि ब्याज की प्रोटीन दोनों एन और सी-टर्मिनल टैग बर्दाश्त, दोनों का परीक्षण किया जाना चाहिए । दरअसल, BioID प्रयोगों में, फ्यूजन प्रोटीन के उंमुखीकरण22लेबलिंग की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं । इसके अलावा, हमने देखा है कि जब प्रोटीन की एक जोड़ी के लिए विभाजन-BioID लागू करने, दो प्रोटीन के जो या तो NBirA * या CBirA * टुकड़ा संलग्न है भी9लेबलिंग की क्षमता को प्रभावित करते हैं । विभाजन में-BioID plasmids, 16 एमिनो एसिड लंबे glycine/serine अमीर बिरा के लिए ब्याज की प्रोटीन युग्मन लिंकर्स * टुकड़े एक और पीसीए23 से लिया और हम अब तक परीक्षण किया है सभी प्रोटीन बातचीत के लिए हमारे लिए काम किया गया । हालांकि, एक विचार करना चाहिए कि कुछ प्रोटीन जोड़े छोटे या लंबे समय के साथ बेहतर काम हो सकता है । अंतिम ध्यान दें, एक और परख Bollen समूह द्वारा वर्णित किया गया था24। इस परख में, बिरा * हमारी तुलना में एक और साइट (E140/Q141) पर विभाजित है (E256/G257) । हम दोनों विभाजन BioID जायके का परीक्षण किया है साथ-साथ और पाया है कि E256/G257, इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, मजबूत पुनः सक्रियण की ओर जाता है जब दो के लिए युग्मित प्रोटीन9।
इस विधि की एक सामांय खामी लेबलिंग की धीमी गति है । आमतौर पर, बायोटिन के साथ 6 से 24 ज मशीन समय प्रशंसनीय biotinylation6प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, precluding प्रोटीन परिसरों के गतिशील पुनर्मॉडलिंग के अध्ययन के लिए इस तकनीक का उपयोग करें । हालांकि इस परख आंशिक रूप से इस चेतावनी के रूप में यह केवल जब दो प्रोटीन बातचीत सक्रिय है, बहुत गतिशील प्रक्रियाओं के लिए प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इसके उपयोग बाधा लेबलिंग की धीमी गति या कम-प्रोटीन रहते विश्लेषण का पता है । इंजीनियर peroxidase APEX2 1 मिनट के भीतर समीपस्थ प्रोटीन के कुशल लेबलिंग को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है3. एक APEX2 पर आधारित पीसीए इस प्रकार BioID की धीमी लेबलिंग गति की सीमाओं को संबोधित कर सकते है परख व्युत्पंन । एक सबूत के सिद्धांत का अध्ययन इस तरह के एक विभाजन APEX2 परख25वर्णित है । हालांकि, हालांकि एक homodimerizing प्रोटीन सफलतापूर्वक biotinylated था, चाहे परख भी लेबल और प्रोटीन है कि बातचीत प्रोटीन की एक जोड़ी के आसपास इकट्ठा की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का प्रदर्शन किया जाएगा । बहुत हाल ही में, विकास का निर्देश TurboID और miniTurbo, बिरा के दो वेरिएंट * बढ़ाया गतिविधि है कि बहुत कम लेबलिंग समय खिड़कियों, 10 मिनट के लिए नीचे26की अनुमति के साथ बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इन नए वेरिएंट के लिए विभाजन BioID अनुकूलन आगे आवेदनों की एक व्यापक क्षेत्र के लिए इस तकनीक के उपयोग का विस्तार होगा ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG) द्वारा जर्मन उत्कृष्टता पहल (CellNetworks DFG-EXC ८१) और सहयोगी अनुसंधान केंद्र SFB638 द्वारा आंशिक वित्तपोषण के माध्यम से वित्त पोषित किया गया.
Acetic acid (glacial) | VWR | 20104.298 | To make TAE buffer |
Agarose | Sigma | A9539 | Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction |
Ammonia solution 25% NH3 | Bernd Kraft | 6012 | To dissolve biotin |
Ampicillin | Sigma | A9518 | To select transformed bacteria |
Bioruptor plus sonification device | Diagenode | B01020001 | Other sonification devices are also ok |
Biotin | Sigma | B4639 | To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation |
Bovine serum albumin fraction V | Carl Roth | 8076 | Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays |
Bradford Ultra reagent | Expedeon | BFU05L | Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents |
Cell scrappers | TPP | 99002 | Any other model is also fine |
ClaI | New England Biolabs | R0197 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion) |
DMEM medium | Sigma | D6046 | If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium |
DNA miniprep kit | Sigma | PLN350 | Any other kit is also fine |
Doxycycline | Applichem | A2951 | Dox is light sensitive |
DTT | Applichem | A2948 | Make 1M stock solution, store at -20 °C and always use fresh |
DyLight 680-conjugated streptavidin | Thermo scientific | 21848 | to use with a LiCor Western blot scanning device |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65002 | The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution) |
EDTA | Applichem | A5097 | Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder |
Ethanol | Sigma | 32205 | Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1 |
Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit | Nippon Genetics | FG-91302 | Any other kit is also fine |
HCl 37% | Merck | 1.00317.1000 | To adjust pH of biotin stock solution |
HEPES | Carl Roth | 6763 | Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4 |
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µm | Millipore | IPFL00010 | This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device |
LiCl | Grüssing GmbH | 12083 | Make a 5M stock solution |
Odyssey CLx imaging system | LI-COR | N/A | To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody |
Linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-2 | Any other transfection reagent is also fine |
Milk powder | Carl Roth | T145 | To block Western blot membranes |
MluI-HF | New England Biolabs | R3198 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion) |
Na-deoxycholate | Sigma | 30970 | Make a 10% (w/v) stock solution |
NaCl | Sigma | 31434 | Make a 5M stock solution |
NP-40 (Nonidet P40 substitute) | Sigma | 74385 | Make a 20% (v/v) stock solution |
PacI | New England Biolabs | R0547 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion) |
Phosphate buffer saline (PBS) | Sigma | 806552 | To wash cells before scrapping |
PmeI | New England Biolabs | R0560 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion) |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693132001 | Added to the lysis buffer to prevent protein degradation |
pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP | Addgene | 90003 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir | Addgene | 90004 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP | Addgene | 90008 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir | Addgene | 90009 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
Q5 High-Fidelity PCR kit | New England Biolabs | E0555S | To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine. |
Quick ligation kit | New England Biolabs | M2200S | To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine. |
RunBlue 4-20% SDS precast gels | Expedeon | BCG42012 | To use when running samples for MS analysis |
RunBlue LDS Sample Buffer | Expedeon | NXB31010 | Running buffer for the RunBlue precast gels |
SDS | Sigma | 5030 | Comes as a 20% stock solution |
tet-free serum | Biowest | S181T | we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins |
Trans-Blot Turbo Transfer system | Bio-Rad | 1704150 | High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine |
Tris | Carl Roth | 4855 | Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8) |
Triton X-100 | Applichem | A4975 | Make a 20% (v/v) stock solution |
Tween-20 | Carl Roth | 9127 | Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step |