Vi leverer en trinvis protokol for split-BioID, en protein fragmenter-komplementering analyse baseret på den nærhed-mærkning teknik BioID. Aktiveret på samspillet mellem to givne proteiner, tillader det proteomics analysen af kontekst-afhængige proteinkomplekser i deres native cellulære miljø. Metoden er enkel, omkostningseffektiv og kræver kun almindeligt laboratorieudstyr.
For at supplere eksisterende affinitet rensning (AP) tilgange til identifikation af protein-protein interaktioner (PPI), har indført enzymer, der giver mulighed for nærhed-afhængige mærkning af proteiner i levende celler. En sådan enzym, BirA * (bruges i BioID tilgang), medierer biotinylation af proteiner inden for en rækkevidde af ca 10 nm. Derfor, når smeltet til en protein af interesse og udtrykt i celler, det giver, mærkning af proksimale proteiner i deres oprindelige miljø. I modsætning til AP, der bygger på rensning af samlet proteinkomplekser, registrerer BioID proteiner, der er markeret i celler, uanset om de stadig interagere med protein af interesse, når de er isoleret. Da det biotinylates proksimale proteiner, man kan desuden kapitalisere på det ekstraordinære affinitet af streptavidin for biotin meget effektivt isolere dem. Mens BioID præsterer bedre end AP til at identificere forbigående eller svage interaktioner, giver begge AP og BioID masse massespektrometri tilgange et overblik over alle mulige interaktioner en given protein kan have. De giver imidlertid ikke oplysninger om som led i hver identificerede PPI. Faktisk, de fleste proteiner er typisk en del af flere komplekser, svarende til forskellige modning trin eller forskellige funktionelle enheder. For at løse denne fælles begrænsning af begge metoder, har vi udviklet en protein-fragmenter komplementering analysen baseret på BirA * enzymet. I denne analyse, kan to inaktive fragmenter af BirA * Saml til en aktiv enzym når bragt i umiddelbar nærhed af to interagerende proteiner som de er smeltet. Resulterende split-BioID analysen giver således mulighed for mærkning af proteiner, der samles omkring et par af interagerende proteiner. Såfremt disse to interagere kun i en given kontekst, split-BioID derefter giver mulighed for analyse af specifikke kontekst-afhængige funktionelle enheder i deres native cellulære miljø. Her, leverer vi en trinvis protokol for at teste og anvende split-BioID til et par af interagerende proteiner.
Som de fleste cellulære funktioner udføres af proteiner, der dynamisk samler makromolekylære komplekser, er identificering af protein-protein interaktioner (PPI) en større bestræbelse i biomedicinsk forskning. Faktisk PPI er ofte dereguleret i sygdom og repræsenterer potentielle mål for therapeutics1. Mest udbredte metode til identifikation af PPI er affinitet rensning (AP) tilgang, hvor, efter celle lysis, et protein af interesse er specielt renset på en matrix og tilknyttede proteiner er efterfølgende identificeret ved massespektrometri (MS). Mens AP-MS er en kraftfuld tilgang, udfører det typisk ikke godt på tungtopløselige proteinkomplekser, meget forbigående interaktioner eller PPI, der kræver en intakt subcellulært struktur. Derudover kan fortolkning af data blive kompliceret af den dynamiske natur af PPI netværk, som en enkelt protein er ofte en del af flere forskellige proteinkomplekser.
Nærhed-mærkning teknikker såsom BioID2 eller APEX23,4 blev for nylig udviklet for at løse nogle af begrænsningerne af AP-MS tilgange. I BioID katalyserer enzym BirA * (svarende til en G115R variant af vildtype E. coli enzym) dannelsen af labile biotinyl-AMP (bio-AMP) som kan reagere med primære aminer. I modsætning til det enzym, vildtype, der bevarer bio-AMP i sin aktive center, frigiver BirA * bio-AMP giver sin diffusion til det omkringliggende miljø. Derfor, når smeltet til en protein af interesse og udtrykt i celler, proksimale proteiner kan være biotinylated inden for en anslået række 10 nm5. Disse markeret proksimale proteiner er derefter isoleret af streptavidin pulldown og identificeret af MS. I modsætning til AP-MS kræver BioID udtryk for en fusion protein. Det kan derfor kun anvendes på proteiner hvis funktion ikke hæmmes af tagging. Desuden hastigheden af mærkning er langsom, typisk 6 – 24 h2,6, hvilket gør opdagelse af kortvarig proteiner udfordrende. Endnu, i forhold til AP-MS, BioID-MS giver adskillige vigtige fordele: første, dens fanger interaktioner i deres native cellulære miljø; andet, mærket proteiner i stedet for samlet komplekser er isoleret efter celle lysis; for det tredje streptavidin pulldowns giver mulighed for ved hjælp af denaturering buffere og barske vask betingelser. Metoden er derfor mere følsomme til at påvise forbigående eller svage interaktioner7 eller samspil, der opstår på en bestemt og skrap hen til isolere subcellulært struktur8.
Men de fleste proteiner er normalt en del af større komplekser, som kan omskabe ifølge cellular køindikatorer eller til den funktion, der skal udføres. Derfor, en enkelt protein er typisk en del af flere komplekser, svarende til forskellige funktionelle enheder, der omfatter særskilt og/eller overlappende PPI. Begge tilgange giver et overblik over alle foreninger en given protein kan have, men de undlader at løse som led i individuelle PPI. For at øge opløsningen af sidstnævnte, har vi designet en protein-fragmenter komplementering analyse (PCA) i hvilke to inaktive fragmenter af BirA * (NBirA *, der indeholder den katalytiske domæne, og CBirA * der kan ses som re-aktivering domæne) kan Saml ind i en aktiv enzym når bragt i umiddelbar nærhed af to interagere proteiner9. Den resulterende split-BioID analysen fokuserer nærhed-afhængige biotinylation på proteiner, der samles omkring et par af interagerende proteiner og herigennem tillader identifikation af kontekst afhængige protein forsamlinger. Vi har for nylig vist fremragende opløsning magt split-BioID ved at løse to særskilte proteinkomplekser involveret i miRNA-medieret genhæmning vej9.
Helt, i et enkelt og simpelt assay, split-BioID giver mulighed for at opdage og specifikt tildeler PPI for definerede funktionelle enheder, hvor en given protein er involveret, forudsat at en supplerende interagerende protein af det tilsvarende protein kompleks er kendt.
Den skitserede fremgangsmåde beskriver, hvordan du klone gener af interesse i split-BioID plasmider, hvordan man tester for interaktion-induceret biotinylation og hvordan du kan isolere biotinylated proteiner til massespektrometri analyse. Vi beskriver her en metode baseret på forbigående Transfektion. Mens udtryk for fusion proteiner kan indstilles af mængden af dox tilsættes til mediet, kan forbigående Transfektion føre til uensartede protein udtryk med nogle celler, der groft overexpress fusion proteiner i forhold til den endogene modparter. Dette kan føre til forvridninger af det tilsvarende interactomes og PPI, der ikke giver et retvisende billede af interaktioner, der involverer de endogene proteiner. Det er således generelt tilrådeligt at konstruere stabil cellelinjer, når split-BioID er blevet etableret med den forbigående system. Plasmider er forenelige med Flp-medierede rekombination system og placere begge gener af interesse reguleres af den samme tet-responderende element. Hvis det er nødvendigt, og når det bruges med kompatible pattedyrceller, tillader de nem oprettelsen af stabile inducerbar cellelinjer. For eksempel, bruge vi linjen HeLa-EM2-11, der udtrykker rtTA tetracyclin-aktiveret transkription aktivere og en unik markedssegment genomisk locus hvorfra tetracyklin-medieret genekspression kan være stramt reguleret12. Brug denne cellelinje og Flp-medierede rekombination, kan stabil cellelinjer, der indeholder kun én kopi af transgenet fås i to-tre uger. Alternativt kunne man også bruge nuværende genom redigering teknikker for at indføre BirA * fragmenter i de indfødte genomiske loci af gener af interesse.
Som i enhver assay, der bygger på kodning en protein, skal man overveje, hvis de resulterende fusion proteiner er funktionelle. Tilgængelige data i som proteiner af interesse blev markeret (for eksempel med normal god landbrugspraksis for billeddiagnostiske undersøgelser) og funktionelt testet er nyttige til at beslutte, hvis BirA * fragmenter bør være klonet opstrøms eller nedstrøms gener af interesse. Hvis ikke sådanne oplysninger foreligger, man bør teste N-terminalt eller C-terminalt markeret proteiner i en funktionel analyse. For eksempel, kan aktiviteten af fusion proteiner testes i en cellelinje, hvori den endogene protein har været bankede-out og forhold til vildtype. Hvis proteiner af interesse tåle både N – og C-terminale tags, skal begge testes. Faktisk, i BioID eksperimenter, orientering af fusion protein kan påvirke effektiviteten af mærkning22. Derudover har vi bemærkede, at når anvende split-BioID til et par af proteiner, hvilket af de to proteiner er føjet til enten den NBirA * eller CBirA * fragment også indflydelse effektivitet mærkning9. I split-BioID plasmider, de 16 aminosyre lang glycin/Serin rige linkers kobling proteiner af interesse at BirA * fragmenter blev taget fra en anden PCA23 og arbejdet for os i alle interagerende proteiner vi har testet indtil videre. Dog bør man overveje at nogle protein par kan fungere bedre med kortere eller længere linkers. Afsluttende note, blev en anden analyse beskrevet af Bollen gruppe24. I denne analyse, er BirA * delt på et andet websted (E140/Q141) end vores (E256/G257). Vi har testet både split-BioID varianter side-by-side og fandt, at E256/G257, beskrevet i denne protokol, fører til stærkere genaktivering når koblet til to interagerende proteiner9.
En generel ulempe ved denne metode er den langsomme hastighed af mærkning. Typisk er 6 til 24 h inkubationstiden med biotin nødvendig for at opnå mærkbare biotinylation6, udelukker brug af denne teknik til at studere dynamisk remodellering af proteinkomplekser. Mens dette assay delvist løser denne advarsel som det aktiveres kun, når to proteiner interagere, langsom hastighed mærkning udelukke dets brug for at studere svar meget dynamiske processer eller analysere kortlivede proteiner. Manipuleret peroxidase APEX2 er kendt for at fremme effektiv mærkning af proksimale proteiner inden for 1 min3. En PCA baseret på APEX2 kan således tage begrænsninger af langsomme mærkning BioID-afledte assays. En proof-of-principle undersøgelse beskrives sådan en split-APEX2 assay25. Selv om en homodimerizing protein var med held biotinylated, er om analysen kan også bruges til at mærke og identificere proteiner, der samles omkring et par af interagerende proteiner imidlertid påvises. For ganske nylig blev styret udviklingen brugt til at oprette TurboID og miniTurbo, to varianter af BirA * med øget aktivitet, der giver mulighed for meget kortere mærkning tidsvinduer, ned til 10 min26. Tilpasse split-BioID til disse nye varianter vil yderligere udvide brugen af denne teknik til et bredere felt af programmer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af det tyske Forskningsråd (DFG) gennem initiativet tysk topkvalitet (CellNetworks DFG-EXC 81) og et delvis finansiering af fælles forskningscenter SFB638.
Acetic acid (glacial) | VWR | 20104.298 | To make TAE buffer |
Agarose | Sigma | A9539 | Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction |
Ammonia solution 25% NH3 | Bernd Kraft | 6012 | To dissolve biotin |
Ampicillin | Sigma | A9518 | To select transformed bacteria |
Bioruptor plus sonification device | Diagenode | B01020001 | Other sonification devices are also ok |
Biotin | Sigma | B4639 | To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation |
Bovine serum albumin fraction V | Carl Roth | 8076 | Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays |
Bradford Ultra reagent | Expedeon | BFU05L | Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents |
Cell scrappers | TPP | 99002 | Any other model is also fine |
ClaI | New England Biolabs | R0197 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion) |
DMEM medium | Sigma | D6046 | If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium |
DNA miniprep kit | Sigma | PLN350 | Any other kit is also fine |
Doxycycline | Applichem | A2951 | Dox is light sensitive |
DTT | Applichem | A2948 | Make 1M stock solution, store at -20 °C and always use fresh |
DyLight 680-conjugated streptavidin | Thermo scientific | 21848 | to use with a LiCor Western blot scanning device |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65002 | The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution) |
EDTA | Applichem | A5097 | Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder |
Ethanol | Sigma | 32205 | Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1 |
Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit | Nippon Genetics | FG-91302 | Any other kit is also fine |
HCl 37% | Merck | 1.00317.1000 | To adjust pH of biotin stock solution |
HEPES | Carl Roth | 6763 | Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4 |
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µm | Millipore | IPFL00010 | This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device |
LiCl | Grüssing GmbH | 12083 | Make a 5M stock solution |
Odyssey CLx imaging system | LI-COR | N/A | To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody |
Linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-2 | Any other transfection reagent is also fine |
Milk powder | Carl Roth | T145 | To block Western blot membranes |
MluI-HF | New England Biolabs | R3198 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion) |
Na-deoxycholate | Sigma | 30970 | Make a 10% (w/v) stock solution |
NaCl | Sigma | 31434 | Make a 5M stock solution |
NP-40 (Nonidet P40 substitute) | Sigma | 74385 | Make a 20% (v/v) stock solution |
PacI | New England Biolabs | R0547 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion) |
Phosphate buffer saline (PBS) | Sigma | 806552 | To wash cells before scrapping |
PmeI | New England Biolabs | R0560 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion) |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693132001 | Added to the lysis buffer to prevent protein degradation |
pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP | Addgene | 90003 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir | Addgene | 90004 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP | Addgene | 90008 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir | Addgene | 90009 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
Q5 High-Fidelity PCR kit | New England Biolabs | E0555S | To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine. |
Quick ligation kit | New England Biolabs | M2200S | To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine. |
RunBlue 4-20% SDS precast gels | Expedeon | BCG42012 | To use when running samples for MS analysis |
RunBlue LDS Sample Buffer | Expedeon | NXB31010 | Running buffer for the RunBlue precast gels |
SDS | Sigma | 5030 | Comes as a 20% stock solution |
tet-free serum | Biowest | S181T | we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins |
Trans-Blot Turbo Transfer system | Bio-Rad | 1704150 | High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine |
Tris | Carl Roth | 4855 | Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8) |
Triton X-100 | Applichem | A4975 | Make a 20% (v/v) stock solution |
Tween-20 | Carl Roth | 9127 | Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step |