Vi gir en trinnvis protokoll for split-BioID, en protein fragmenter-complementation analysen basert på nærhet-merking teknikken BioID. Aktivert på samspillet av to gitt proteiner, kan Proteomikk analyse av sammenhengen-avhengige proteiner komplekser i sitt opprinnelige mobilnettet miljø. Metoden er enkel, kostnadseffektiv og krever bare standard laboratorieutstyr.
For å utfylle eksisterende affinitet rensing (AP) tilnærminger til å identifisere protein-protein interaksjoner (PPT), enzymer har innført at nærhet-avhengige merkingen av proteiner i levende celler. En slik enzym, BirA * (brukt i BioID tilnærming), formidler biotinylation proteiner innenfor en rekkevidde på ca 10 nm. Derfor når smeltet til et protein av interesse og uttrykt i celler, kan merkingen av proksimale proteiner i sitt eget miljø. I motsetning til AP som rensing av sammensatte protein komplekser, oppdager BioID proteiner som er merket i celler uansett om de fortsatt samhandler med protein av interesse når de er isolert. Siden det biotinylates proksimale proteiner, kan en videre kapitalisere på det eksepsjonelle affinitet til streptavidin for biotin svært effektivt isolere dem. Mens BioID utfører bedre enn AP identifiserende forbigående eller svak interaksjoner, gir begge AP – og BioID-masse massespektrometri tilnærminger en oversikt over alle mulig interaksjoner et bestemt protein kan ha. Men gir de ikke informasjon i forbindelse med hver identifisert PPI. Faktisk er de fleste proteiner vanligvis en del av flere komplekser, svarer til forskjellige modning trinn eller ulike funksjonelle enheter. For å løse denne felles begrensning av begge metodene, har vi utviklet en protein-fragmenter complementation analysen basert på BirA * enzymet. I denne analysen, kan to inaktive fragmenter av BirA * montere i en aktiv enzym når brakt i nærheten av to samspill proteiner som de er smeltet. Resulterende split-BioID analysen kan dermed merkingen av proteiner som sammen rundt et samspill proteiner. Gitt disse to bare samhandle i en gitt kontekst, tillater split-BioID deretter analyse av bestemt sammenheng-avhengige funksjonelle enheter i sitt opprinnelige mobilnettet miljø. Her gir vi en trinnvis protokoll for å teste og bruke split-BioID til et par samspill proteiner.
Som mest cellular funksjonene utføres ved proteiner som dynamisk samle macromolecular komplekser, er identifikasjon av protein-protein interaksjoner (PPT) en stor oppgave i biomedisinsk forskning. Faktisk er ofte deregulert sykdom og representerer potensielle mål for therapeutics1. Mest brukte metoden for identifikasjon av PPT er affinitet rensing (AP) tilnærming som cellen lysis, et protein av interesse er spesielt renset på en matrise og tilhørende proteiner identifiseres senere massespektrometri (MS). AP-MS er en effektiv tilnærming, utføre det vanligvis ikke godt på dårlig løselig protein komplekser, veldig forbigående interaksjoner eller PPI som krever en intakt subcellular struktur. Videre kan tolkningen av dataene være komplisert av dynamikken i PPI nettverk, som en enkelt protein er ofte en del av flere forskjellige protein komplekser.
Nærhet-merking teknikker som BioID2 eller APEX23,4 ble nylig utviklet for å løse noen av begrensningene av AP-MS tilnærminger. I BioID gir enzymet BirA * (tilsvarende en G115R variant av vill type E. coli enzym) dannelsen av labilt biotinyl-AMP (bio-AMP) som kan reagere med primære aminer. I motsetning til vill type enzymet, som beholder bio-AMP aktive midt, utgivelser BirA * bio-AMP slik at dens diffusjon til nærliggende miljøet. Derfor når smeltet til et protein av interesse og uttrykt i celler, kan proksimale proteiner være biotinylated i en anslått rekkevidde på 10 nm5. Disse merket proksimale proteiner deretter isolert av streptavidin pulldown og identifisert av MS. I motsetning til AP-MS krever BioID uttrykk for en fusjon protein. Det kan derfor bare brukes proteiner som funksjon ikke er hemmet av merking. Dessuten hastigheten på merking er treg, vanligvis 6-24 h2,6, gjør påvisning av kortvarige proteiner utfordrende. Likevel, i forhold til AP-MS, BioID-MS tilbyr flere viktige fordeler: første, sin fanger samhandlinger i deres opprinnelige mobilnettet miljø; andre, merket proteiner i stedet for sammensatte komplekser er isolert etter celle lysis; tredje tillate streptavidin pulldowns denaturing buffere og harde vask forhold. Derfor er metoden mer følsom å oppdage forbigående eller svak interaksjoner7 eller samhandlinger som oppstår på en bestemt og vanskelig å isolere subcellular struktur8.
Men er de fleste proteiner vanligvis en del av større komplekser som kan renovere ifølge cellular signaler eller funksjonen som må utføres. Derfor er et enkelt protein vanligvis en del av flere komplekser, tilsvarer ulike funksjonelle enheter, som involverer forskjellige og/eller overlappende PPI. Begge metodene gir en oversikt over alle foreninger har et bestemt protein, men de ikke sammenheng med personlige PPI. Hvis du vil øke oppløsningen for sistnevnte, har vi utviklet en protein-fragmenter complementation analysen (PCA) som to inaktive fragmenter av BirA * (NBirA *, som inneholder katalytisk domenet, og CBirA * som kan vises som re-aktivisering domenet) kan reassemble i en aktiv enzym når brakt i nærheten av to samspill proteiner9. Resulterende split-BioID analysen fokuserer nærhet-avhengige biotinylation på proteiner som samle rundt et par samspill proteiner og dermed tillater identifikasjon av sammenheng avhengige protein samlinger. Vi nylig vist fremragende oppløsning makt split-BioID ved å løse to distinkt proteinet komplekser involvert i miRNA-mediert gen-stanse veien9.
Sammen i en enkelt, enkel analysen kan split-BioID oppdage og spesielt tilordne PPT til definerte funksjonsenhetene som et bestemt protein er involvert, gitt en mer samhandlende protein av tilsvarende proteinet er kjent.
Disponerte fremgangsmåten beskriver hvordan klone gener av interesse i split-BioID plasmider, hvordan å teste for samhandling-indusert biotinylation og isolere biotinylated proteiner for massespektrometri analyse. Her beskriver vi en prosedyre basert på forbigående transfection. Mens uttrykket av fusion proteiner stilles av mengden dox lagt til mediet, kan forbigående transfection føre til ikke-homogen protein uttrykk med noen celler som grovt overexpress fusion proteiner i forhold til den endogene kolleger. Dette kan føre til forvrengninger av det tilsvarende interactomes og PPT, som ikke reflekterer trofast interaksjoner som involverer endogene proteiner. Dermed er det vanligvis lurt å konstruere stabil cellelinjer når split-BioID er etablert med forbigående systemet. Plasmider er kompatible med Flp-mediert rekombinasjon systemet og plassere begge gener rundt under regulering av samme tet svarer element. Hvis nødvendig, og når den brukes med kompatibel pattedyrceller, tillater de enkel oppretting av stabil induserbart linjer. For eksempel bruker vi jakten-EM2-11 linjen som uttrykker rtTA tetracycline-aktivert transkripsjon aktivatoren og et unikt targetable genomisk locus som tetracycline-mediert genuttrykk kan være strengt regulert12. Bruker denne cellen linje og Flp-mediert rekombinasjon, kan stabil linjer som inneholder bare én kopi av transgene fås i to-tre uker. Alternativt kan en også bruke gjeldende genomet redigering teknikker for å innføre BirA * fragmenter i de opprinnelige genomisk loci av genene rundt.
Som noen analysen som merking et protein, må man vurdere hvis de resulterende fusion proteinene er funksjonelle. Tilgjengelige data som proteiner av interesse ble merket (for eksempel med GFP for imaging studier) og funksjonelt testet er nyttige å avgjøre hvis BirA * fragmenter skal klones oppstrømshastighet eller nedstrøms gener av interesse. Hvis ingen slike data er tilgjengelig, en bør teste N-Terminal eller C-terminalt merket proteiner i en funksjonell analysen. For eksempel kan aktiviteten til fusion proteinene testes i en celle linje som endogene protein er slo ut og sammenlignet med vill type situasjonen. Hvis proteiner rundt tolerere begge N – og C-terminalen koder, bør begge testes. Faktisk BioID eksperimenter, kan retningen på fusion protein påvirke effektiviteten av merking22. Dessuten, har vi observert at når bruke split-BioID til et par av proteiner, hvilken av de to proteinene legges til enten i NBirA * eller CBirA * fragment også innflytelse effektiviteten av merking9. I delt-BioID plasmider, den 16 aminosyre lang glysin/serine rik linkers kopling proteiner rundt BirA * fragmenter ble tatt fra en annen PCA23 og arbeidet for oss i alle samspill proteiner vi har testet så langt. Imidlertid bør man vurdere at noen protein par kan fungere bedre med kortere eller lengre linkers. Av siste notat, ble en annen analysen beskrevet av Bollen gruppe24. I denne analysen deles BirA * på et annet nettsted (E140/Q141) enn vår (E256/G257). Vi har testet begge split-BioID smaker av siden og fant at E256/G257, beskrevet i denne protokollen, fører til sterkere re-Activation kombinert to samspill proteiner9.
En generell ulempen med denne metoden er treg hastighet på merking. 6 til 24 h inkubasjon tid med biotin er vanligvis nødvendig for å oppnå betydelige biotinylation6, slik at bruk av denne teknikken for å studere dynamisk ombygging av protein komplekser. Mens denne analysen delvis løser denne påminnelse som aktiveres bare når to proteiner samhandler, treg hastighet på merking utelukke bruken for å studere svar til svært dynamisk prosesser eller analysere kortvarig proteiner. Den utviklet peroxidase APEX2 er kjent for å fremme effektiv merking av proksimale proteiner i 1 min3. En PCA basert på APEX2 kan dermed adresse begrensningene for treg merking hastighet på BioID-avledet analyser. En bevis-av-prinsippet studie beskrevet slik en split-APEX2 analysen25. Men selv om en homodimerizing protein var vellykket biotinylated, gjenstår om analysen kan også brukes til å merke og identifisere proteiner som sammen rundt et samspill proteiner å bli demonstrert. Nylig, regissert utviklingen ble brukt til å opprette TurboID og miniTurbo, to varianter av BirA * forbedret aktivitet at mye kortere merking tidsvinduer, ned til 10 min26. Tilpasse split-BioID til disse nye varianter vil ytterligere utvidet bruk av denne teknikken til et bredere felt av programmer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av tysk forskningsråd (DFG) gjennom tyske excellence initiativ (CellNetworks DFG-EXC 81) og en delvis finansiering av forskningssamarbeid centre SFB638.
Acetic acid (glacial) | VWR | 20104.298 | To make TAE buffer |
Agarose | Sigma | A9539 | Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction |
Ammonia solution 25% NH3 | Bernd Kraft | 6012 | To dissolve biotin |
Ampicillin | Sigma | A9518 | To select transformed bacteria |
Bioruptor plus sonification device | Diagenode | B01020001 | Other sonification devices are also ok |
Biotin | Sigma | B4639 | To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation |
Bovine serum albumin fraction V | Carl Roth | 8076 | Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays |
Bradford Ultra reagent | Expedeon | BFU05L | Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents |
Cell scrappers | TPP | 99002 | Any other model is also fine |
ClaI | New England Biolabs | R0197 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion) |
DMEM medium | Sigma | D6046 | If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium |
DNA miniprep kit | Sigma | PLN350 | Any other kit is also fine |
Doxycycline | Applichem | A2951 | Dox is light sensitive |
DTT | Applichem | A2948 | Make 1M stock solution, store at -20 °C and always use fresh |
DyLight 680-conjugated streptavidin | Thermo scientific | 21848 | to use with a LiCor Western blot scanning device |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65002 | The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution) |
EDTA | Applichem | A5097 | Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder |
Ethanol | Sigma | 32205 | Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1 |
Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit | Nippon Genetics | FG-91302 | Any other kit is also fine |
HCl 37% | Merck | 1.00317.1000 | To adjust pH of biotin stock solution |
HEPES | Carl Roth | 6763 | Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4 |
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µm | Millipore | IPFL00010 | This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device |
LiCl | Grüssing GmbH | 12083 | Make a 5M stock solution |
Odyssey CLx imaging system | LI-COR | N/A | To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody |
Linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-2 | Any other transfection reagent is also fine |
Milk powder | Carl Roth | T145 | To block Western blot membranes |
MluI-HF | New England Biolabs | R3198 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion) |
Na-deoxycholate | Sigma | 30970 | Make a 10% (w/v) stock solution |
NaCl | Sigma | 31434 | Make a 5M stock solution |
NP-40 (Nonidet P40 substitute) | Sigma | 74385 | Make a 20% (v/v) stock solution |
PacI | New England Biolabs | R0547 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion) |
Phosphate buffer saline (PBS) | Sigma | 806552 | To wash cells before scrapping |
PmeI | New England Biolabs | R0560 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion) |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693132001 | Added to the lysis buffer to prevent protein degradation |
pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP | Addgene | 90003 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir | Addgene | 90004 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP | Addgene | 90008 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir | Addgene | 90009 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
Q5 High-Fidelity PCR kit | New England Biolabs | E0555S | To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine. |
Quick ligation kit | New England Biolabs | M2200S | To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine. |
RunBlue 4-20% SDS precast gels | Expedeon | BCG42012 | To use when running samples for MS analysis |
RunBlue LDS Sample Buffer | Expedeon | NXB31010 | Running buffer for the RunBlue precast gels |
SDS | Sigma | 5030 | Comes as a 20% stock solution |
tet-free serum | Biowest | S181T | we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins |
Trans-Blot Turbo Transfer system | Bio-Rad | 1704150 | High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine |
Tris | Carl Roth | 4855 | Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8) |
Triton X-100 | Applichem | A4975 | Make a 20% (v/v) stock solution |
Tween-20 | Carl Roth | 9127 | Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step |