Il protocollo descritto in questo documento utilizza il muscolo di longus di levator auris (LAL) del mouse per registrare spontanea e nervo-evocata potenziali postsinaptici (corrente-clamp) e correnti (tensione-clamp) alla giunzione neuromuscolare. Utilizzo di questa tecnica può fornire spunti chiave nei meccanismi della trasmissione sinaptica in condizioni normali e malattia.
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Articolo metodologico
Levator Auris Longus Preparazione per l'esame della trasmissione neuromuscolare dei mammiferi sotto condizioni di morsetto di tensione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive una tecnica di trasmissione sinaptica record dalla giunzione neuromuscolare in condizioni di corrente- e tensione-morsa. Una preparazione ex vivo di levator auris longus (LAL) è usata perché è un muscolo sottile che fornisce una visualizzazione semplice della giunzione neuromuscolare per impalamento microelettrodo presso il terminale del motoneurone. Questo metodo consente la registrazione dei potenziali spontanei miniatura della piastra laterale e correnti (mEPPs e mEPCs), i potenziali evocati del nervo della piastra laterale e correnti (EPPs ed EPCs), come pure le proprietà della membrana dei motoneurone. Risultati ottenuti da questo metodo includono il contenuto quantal (QC), numero di siti di rilascio delle vescicole (n), probabilità di rilascio delle vescicole (prel), facilitazione sinaptica e depressione, nonché la costante di tempo della membrana muscolare (τ m) e la resistenza di ingresso. Applicazione di questa tecnica di modelli murini di malattia umana può evidenziare patologie chiave negli Stati di malattia e aiutare a identificare nuove strategie terapeutiche. Dal completamente tensione-serraggio di una singola sinapsi, questo metodo fornisce una delle analisi più dettagliate della trasmissione sinaptica attualmente disponibili.
Introduzione
Studiando la trasmissione sinaptica alla giunzione neuromuscolare fornisce approfondimenti il rapporto dinamico tra i sistemi nervosi e scheletrici muscolari ed è un eccellente modello per l'esame di fisiologia sinaptica. Il levator auris longus (LAL) è un muscolo sottile, permettendo per le giunzioni neuromuscolari possano essere facilmente visualizzati. Rapporti precedenti hanno descritto la convenienza di usando il LAL per esaminare le tossine e droghe sinaptiche e hanno caratterizzato le caratteristiche del tipo di fibra muscolare scheletrica del leone1,2. Numerosi studi hanno utilizzato la LAL pe....
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Protocollo
Animale tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la cura degli animali e uso Comitato di Wright State University.
1. Mouse eutanasia
- In una cappa, posizionare il mouse in un vetro ermetico anestetizzando camera.
- Esporre il mouse tramite inalazione di una dose letale di isoflurane (saturazione, o ~ 25%). Lascia il mouse nel vano fino a quando non respira può essere osservato.
- Rimuovere il mouse dalla camera ed eseguire una dislocazione cervicale come metodo secondario dell'eutanasia.
2. rimozione dei capelli dalla superficie dorsale della testa, collo e schiena
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Risultati
Figura 8 Mostra un esempio di impulsi di corrente (Figura 8A) e le risposte di tensione (Figura 8B) da una fibra di LAL sotto corrente-pinza da un 12-week-old wild type R6/2 del mouse. La presenza di mEPPs indica che questi record sono state prese dal terminale del motoneurone. I record sono stati ottenuti in soluzione fisiologica normale. Questi record corrente-morsetto possono essere analizzati per.......
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Discussione
È descritto qui la preparazione e l'uso del mouse del muscolo LAL per la misura della trasmissione neuromuscolare in condizioni di corrente o tensione morsetto. Ci sono diversi punti importanti da considerare per la dissezione fuori il LAL. Pulizia del tessuto connettivo in eccesso l'AIDS di muscolo in impalamento elettrodo, come gli elettrodi riesci a scroccare il tessuto connettivo quando loro posizionamento per impalamento. Tuttavia, rimuovere solo il tessuto connettivo che può essere tolto facilmente per limitare le .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Si ringraziano il Dr. Mark M. Rich e Daniel Miranda per Commenti editoriali, Ahmad Khedraki per aiutare a stabilire questa tecnica e Wright State University per il sostegno finanziario (fondo di avvio per A.A.V.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio composto Olympus | Olympus | BX51WI | |
| 10x Obiettivo | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Obiettivo | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Vetro borosilicato | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD | Camera Santa Barbara Instruments Gruppo | ST-7XMEI | |
| Mater-9 Pulse Generatore | AMPI | ||
| Iso-flex Stimolo Isolatore | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Software di acquisizione e analisi dati | Dispositivi molecolari | 1-2500-0180 | |
| Elettrodo bipolare concentrico | FHC | CBDSH75 | |
| Manipolatore con giunto sferico | Narishige | ||
| Siringhe non metalliche 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Stereomicroscopio | Nikon SMZ800N | ||
| n. 5 Pinze | Strumenti per la scienza | ||
| fine Forbici a molla | Strumenti per la scienza fine | 15006-09 | |
| N. 2 Pinze | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissezione Forbici | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Kit elastomero siliconico | Dow Corning | 2404019862 | |
| Crema depilatoria | Nair | ||
| Grass SD9 Stimolatore | Grass Medical | ||
| P-1000 Estrattore per micropipette | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Sistema di acquisizione dati a basso rumore | Molecular Devices Filtro | ||
| passa-basso Bessell | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Micromanipolatore mancino | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Micromanipolatore destrorso | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Singolo Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Micromanipolatore a rulli incrociati | Siskiyou Corp. | MX1641R | Questo è stato aggiunto all'asse Z dei micromanipolatori sinistro e destro per consentire la motorizzazione dell'asse z. Questa configurazione personalizzata è più economica e meno ingombrante rispetto all'acquisto di un micromanipolatore motorizzato a 4 assi. Ci consente inoltre di controllare entrambi i micromanipolatori con un unico controller |
| Tutti i prodotti chimici sono stati ordinati da Fisher, ad eccezione | |||
| di BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Le sonde molecolari non sono più un'azienda. Ora ordinato tramite Fisher |
Riferimenti
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D.
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Ristampe e permessi
