מרים Auris הארוך הכנה לקראת בחינת בתרבית של התמסורת Neuromuscular בתנאים קלאמפ מתח
Summary
הפרוטוקול המתואר במאמר זה משתמש בעכבר השריר מרים auris הארוך (LAL) כדי להקליט ספונטנית, עורר עצב postsynaptic פוטנציאל (זרם-קלאמפ) וזרמים (מתח-קלאמפ) באזור צומת עצב-שריר. שיטה זו יכולה לספק תובנות מפתח במנגנונים של ההעברה הסינאפסית בתנאים רגיל ומחלות.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר טכניקה כדי להקליט הסינאפסית מצומת neuromuscular בתנאים הנוכחיים-קלאמפ, מתח-קלאמפ. הכנה ex-vivo של מרים auris הארוך (LAL) משמש כי זה שריר דק המעניק קל ויזואליזציה של צומת עצב-שריר חלוקה בניצב microelectrode-motor endplate. שיטה זו מאפשרת ההקלטה של פוטנציאל endplate מיניאטורי ספונטנית, זרמים (mEPPs ו- mEPCs), עורר עצב endplate פוטנציאל וזרמים (אפס ו- EPCs), כמו גם את מאפייני ממברנה motor endplate. התוצאות המתקבל בשיטה זו כוללות בתוכן quantal (קיו סי), מספר האתרים שחרור שלפוחית (n), ההסתברות של שלפוחית שחרור (prel), ההנחיה סינפטית, דיכאון, כמו גם את קרום זמן קבוע של השריר (τ מ’) קלט ההתנגדות. יישום של טכניקה זו על העכבר מודלים של מחלות אנושיות יכול להאיר את מפתח פתולוגיות במצבי מחלה, לסייע בזיהוי אסטרטגיות טיפול חדשניים. מאת מלא מתח-מחבר חובק למעקה סינפסה בודדת, שיטה זו מספקת באחד הניתוחים המפורט ביותר של ההעברה הסינאפסית זמין כרגע.
Introduction
לומד הסינאפסית באזור צומת עצב-שריר מספק תובנות לתוך מערכת היחסים דינמי בין המערכות שרירי העצבים והשלד, הוא מודל מצוין לבחינת פיזיולוגיה סינפטית. מרים auris הארוך (LAL) הוא שריר דק, המאפשר צמתי neuromuscular ניתן לאבחן בקלות. בדו”חות קודמים תיארו שם משתמש את LAL לבחון סינפטית סמים ורעלים, שאפיינו את מאפייני סוג סיבי השריר והשלד של1,לל2. מחקרים רבים ניצלו את LAL לבחון פיזיולוגיה neuromuscular3,4,5,6,7,8. עבור אלקטרופיזיולוגיה, את היכולת להבחין בקלות צמתי neuromuscular LAL מאפשר מיקום מדויק של microelectrodes-motor endplate ואת מקטינה באופן משמעותי בעיות קלאמפ שטח ההקלטות הסינאפסית. . מלחציים צולבים הנוכחי הקלטות של המאפיינים ממברנה שרירים, כגון ממברנה זמן קבוע (τמ’), התנגדות קלט (מוב) מתקבלים בקלות. יתר על כן, ניתן למדוד מאפיינים אלה של סיבי השריר אותו שימוש לתיעוד התמסורת neuromuscular, המאפשר השוואה ישירה של פונקציה סינפטית במאפיינים ממברנה שריר. ניתוח של נתונים אלה יכולים לספק תובנות מפתח במנגנונים הפיזי של מחלות נוירומוסקולריות ומדינות רבות של פעילות שונה.
היבט בטכניקה המתוארת כאן הוא השימוש של מתח-קלאמפ להקלטות סינפטית, אשר אינם כפופים הלא-linearities נתקל הנוכחי-קלאמפ ואינן תלויות המאפיינים ממברנה שריר. יתרונות השימוש מתח-קלאמפ לעומת הנוכחי-קלאמפ לבחון את התמסורת neuromuscular הוקמו על ידי חלוצי המאמצים ב שנות ה-509. תחת זרם-קלאמפ, אפסס עולה על 10-15 mV משרעת אינם תוצר ליניארי של משרעת mEPP9. לדוגמה, אם mEPP הממוצע הוא 1 mV, EPP של 5 mV אפשר להניח להיות התוצר של 5 mEPPs (קיו סי 5); הואיל EPP של 40 mV יהיה התוצר של mEPPs יותר מ-40. זה הלא-ליניאריות-אפס גדול יותר מתרחשת כיוון הכח הדוחף עבור EPP, אשר ההבדל בין פוטנציאל ממברנה פוטנציאל שיווי משקל של הקולטן אצטילכולין (~-10 mV), פוחתת באופן משמעותי במהלך אפס גדול. בעיה זו הוא נמנע בניסויים מתח-קלאמפ, כי פוטנציאל ממברנה שריר אינו משתנה במהלך הניסויים מתח-קלאמפ. החיסרון הוא מתח-קלאמפ ניסויים טכנית קשה יותר להשלים מאשר הנוכחי-קלאמפ הקלטה. עם זאת, מקלכלן ומרטין פיתח תיקון מתמטית פשוטה that חשבונות for הלא-linearities בהקלטות הנוכחי-קלאמפ אפסס10. התיקונים עובדים טוב11,12,13, אך, חשוב להניח המאפיינים ממברנה שריר לא שובשו.
המאפיינים ממברנה שריר חשובים במיוחד לשקול אם לומד תנאים או מצבי מחלה לשבש את השריר. לדוגמה, שרירי השלד מהמודל הטרנסגניים R6/2 של מחלת הנטינגטון היא hyperexcitable עקב ירידה פרוגרסיבית מנוחתו כלורי, אשלגן זרמי14,15. כתוצאה מכך, mEPPs, אפסס הם מוגבר בשרירי השלד R6/2. . בהחלט, גורמים נוספים יכולים לשנות mEPPs, אפס. עבודה עם מודל שונה של מחלת הנטינגטון עכברים (R6/1) נמצאו שינויים אפסס זה נראה להיות קשורה מוקש-חלבונים8. כדי להעריך את מנגנוני גרימת התמסורת neuromuscular מסולף, זה יהיה מועיל לחסל את ההשפעות של שריר שינו ממברנה מאפיינים באמצעות מתח-מלחציים. במחקר שנערך לאחרונה, התמסורת neuromuscular R6/2 נחקר תחת שני התנאים מהדק זרם מתח בטכניקה המתוארת במסמך זה. מכלול של endplates המנוע היו מתח מהודקי עם פחות מ- 1% השגיאה על-ידי הצבת שני microelectrodes בתוך אורך קבוע endplate ה-16. היא הוצגה על המתח-המלחציים, תיקן רשומות הנוכחי-קלאמפ הניב מדידות מנוגדים של התמסורת neuromuscular בשריר R6/2. זה מדגיש כי ייתכן שתתקשה לתיקון אפסס הלא-linearities אם המאפיינים ממברנה שריר שונתה, מציגה את היתרונות של קבלת מתח-קלאמפ רשומות שאינן תלויות המאפיינים ממברנה שריר. פרוטוקול שהוצגו במסמך זה הינו אידיאלי עבור בחינת תנאים או מצבי מחלה המשפיעות הסינאפסית והמאפיינים postsynaptic ממברנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
המתוארים כאן הוא הכנת השימוש בעכבר LAL שריר לשקילת התמסורת neuromuscular בתנאים מהדק זרם או מתח. ישנן מספר נקודות חשובות שיש לקחת בחשבון ניקוד החוצה לל. ניקוי עודף רקמת חיבור של כל העזרים השריר ב חלוקה בניצב אלקטרודה, כמו האלקטרודות יכול להרים רקמת החיבור כאשר והצב אותן עבור חלוקה בניצב. עם זאת, רק …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר מארק מ עשיר ומירנדה דניאל על הערות, Khedraki אחמד שעזרת להקים זה טכניקה, אוניברסיטת המדינה של רייט עבור תמיכה כספית (קרן אתחול כדי A.A.V.).
Materials
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Axoclamp 900A Amplifier | Molecular Devices | 2500‐0179 | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher | |
Riferimenti
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neuroscienze. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington’s mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington’s Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. . The anatomy of the rat. , (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. . Electric current flow in excitable cells. , (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neuroscienze. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
