Summary
여기, 우리는 프로토콜 Zebrafish 애벌레에서 2 광자 레이저로 뉴런의 유전자 표시 부분 모집단을 ablate을 제시.
Abstract
동작에서 뉴런의 부분 모집단의 역할을 확인 하려면 차단 하는 살아있는 동물에 그것의 활동의 결과 테스트 필수적 이다. 레이저 절제 뉴런의 신경 세포는 선택적으로 형광 프로브로 표시 된 경우이 목적을 위해 효과적인 방법입니다. 현재 연구에서 레이저 ablating 신경 2 광자 현미경을 사용 하 고 그 기능 및 행동 결과의 테스트의 부분 모집단에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 연구에서 zebrafish 애벌레에 먹이 캡처 동작 연구 모델로 사용 됩니다. 이 시각 기반 먹이 잡는 동작을 기초 pretecto hypothalamic 회로 알려져 있다. 제 브라 pretectum 레이저 녹지, 그리고 열 등 한 엽 (ILH; pretectal 투영의 대상) 시상 하 부의 신경 활동 조사 되었다. Pretectal 제거 후 먹이 캡처 동작 또한 시험 되었다.
Introduction
동작 뇌의 신경 활동에서 발생 하는 방법을 이해 하는 그 행동의 생성에 관여 하는 신경 회로 식별할 필요가 있다. 애벌레 단계에서 zebrafish는 그들의 작은, 투명 한 두뇌는 신경 활동의 광범위 한 영역에서 셀룰러 해상도에서 조사를 가능 하 게 하기 때문에 동작와 관련 된 두뇌 기능을 공부에 대 한 이상적인 동물 모델을 제공 합니다 1동작 관찰 하는 동안 두뇌입니다. 특정 뉴런에 신경 활동의 이미징 유전자 인코딩된 칼슘 (Ca) 지표 (GECIs) GCaMP2등의 발명을 통해 가능한 되고있다. 제 브라 GCaMP 유전자 변형 동물3행동에서 Ca 이미징 실시 하 여 동작 기능 신경 회로 연결 하는 데 유용 하 게 입증 했습니다.
Ca 이미징 신경 활동과 행동 사이의 상관 관계를 설명할 수 있다, 그러나 인과 관계, 보여 신경 활동과 행동에 그것의 consequence(s)를 테스트의 중요 한 단계가 있습니다. 이를 위해 다양 한 방법이 있다: 특정 신경 회로4, 특정 뉴런5,6, halorhodopsin7, optogenetic 도구를 사용 하 여 신경의 표현 변경 유전자 변이의 사용 및 레이저 타겟된 신경8,9의 제거. 레이저 절제술은 상대적으로 적은 수의 특정 뉴런에 활동을 제거에 대 한 특히 적합 합니다. 신경 세포를 죽 여 신경 활동의 돌이킬 수 없는 제거 행동 결과 평가 촉진 한다.
Zebrafish의 애벌레 단계에서 관찰 될 수 있는 하나의 재미 있는 행동은 먹이 캡처 (그림 1A). 시력10, visuomotor 변환11,,1213, 시각 지 각의 인식의 연구에 대 한 유리한 실험 시스템을 제공 하는이 시각 가이드, 목표 지시 동작 개체14,15,,1617,18, 그리고 의사 결정19. 어떻게 먹이 neuroethology20에서 중앙 질문 되었습니다 잡는 행동 포식 자와 먹이 탐지 먹이를 리드 하는 방법에 의해 인식 된다. 이 문서에서 우리는 pretectum에서 핵의 계획에 의해 형성 된 pretecto hypothalamic 회로의 역할에 초점 (핵 pretectalis superficialis 갈 거 예요 magnocellularis,이 하, 간단 하 게는 pretectum으로 표시)에 ILH 하. pretectum의 레이저 절제 먹이 캡처 활동을 줄이고 ILH 시각적 먹이 지 각21와 관련 된 신경 활동 폐지를 표시 했다. 여기, 수행을 위한 프로토콜 레이저 절제 및 애벌레 설명 zebrafish의 캘리포니아2 + 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 그것의 효과 테스트.
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Protocol
1. 절제 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여 신경 세포의 부분 모집단의
참고: 사용자가 Ca 이미징 다음 제거 수행 계획, UAShspzGCaMP6s 선21을 사용 합니다. 사용자 행동 기록 제거 다음 수행 계획, EGFP 긍정적인 세포의 제거는 GCaMP6s 표현 세포의 보다 수행 하기가 UAS:EGFP 라인을 사용 합니다.
- 특정 뉴런 공부 하 고 UAS:EGFP 또는 UAShspzGCaMP6s 레이블 Gal4 라인의 짝짓기를 설정 하 여 시작 합니다. 부모에 대 한 nacre 배경을 사용할 수 nacre homozygotes를 얻을 수 있도록 해야 합니다.
참고: Nacre 의 homozygotes 아니 melanophores 몸 표면 (그림 1B)에 포함 되어 있습니다. 현재에서 연구, (이 pretectum 라벨) Gal4 선 gSAIzGFFM119B와 다른 Gal4 라인 hspGFFDMC76A (이 ILH 레이블) 사용된21입니다. - 짝짓기 설치의 다음 날, zebrafish 계란을 수집 하 고 어느 시점에서 관심의 뉴런 형광 기자 익스프레스는 애벌레 단계에 그들을 제기.
- 2% 낮은 융 점 agarose (그림 1B)에서 zebrafish 애벌레를 탑재 합니다.
- 2 %agarose 재고 솔루션을 준비 하 여 시작: 2 세대 분해 (즉, 성인 zebrafish 물 순환 시스템에서을 유지 하는 데 사용 하는 물) 100 mL 시스템 물에 낮은 녹는점 agarose 분말의22 또는 E3 물23, 물 여 포인트는 전자 레인지에 끓는과 적극적으로 혼합.
- 그것은 종 기까지 2% 낮은 녹는점 agarose 주식을 전자 레인지. 6 cm 배양 접시의 뚜껑에 agarose의 3.5-4.0 mL를 붓으십시오. agarose 냉각을 계속 하기 전에 터치에 따뜻한 때까지 기다립니다.
- 다음으로 agarose에 하나의 유 충 (이 단계에서 하지 마 취)를 배치 합니다. 그것은 직 립 해 바늘 (그림 1의C)를 사용 하 여 위치와 유 충의 방향을 조절 유지는 agarose는 유 충의 적절 한 위치를 보장 하기 위해 굳은 때까지.
참고: 유 충은 agarose 굳은 동안 주위 수영 계속 것입니다. - 일단 유 충, 위치를 완전히 응고 agarose 위한 5 분 수 있습니다.
- Tricaine 솔루션 (작업 농도 x 1 0.4%)의 5 mL는 agarose 붓는 다.
참고: 동안을 피하기 위해 움직임 애벌레에 의해 레이저 절제, 애벌레 유지 해야 제거 절차를 통해 마 취.
- 두 광자 레이저 현미경 시스템에 표백 기능을 사용 하 여 유 충 ablate
- Agarose 내장 유 충 2 광자 레이저 스캔 현미경 아래 놓고 현미경 시스템을 시작 합니다.
- 이미지 수집 소프트웨어 및 레이저 (그림 1D) 설정 하려면 "레이저" 탭에서 "On" 버튼을 클릭 하십시오. "다른 용무 중"에서 "모드-잠겨 있습니다."로 변경 하는 레이저의 "상태"에 대 한 대기
- "채널" 탭에서 880에서 레이저의 파장을 설정 nm (최대 전력: 약 2300 mW) EGFP 절제, 또는 800 nm (최대 전력: 약 2600 mW) GCaMP 절제술에 대 한.
- 20 X 객관적 렌즈 렌즈 리볼버를 수동으로 이동 하 여 선택 합니다. "찾기" 탭을 클릭, 클릭 "GFP" 광학 경로 변경 하 여 직접 눈으로 형광을 볼.
- 보기;의 센터에서 zebrafish 애벌레 뇌를 찾습니다 다음 두 광자 현미경으로 돌아가기 위해 "수집" 탭을 클릭 합니다.
- '절제' 전에 상태 기록, 빠른 검색 속도 ()을 피하기 위해 열 손상에서 렌즈는 20 X와 z-스택 이미지를 가져가 라. 나중에 이미지가 제거 실험 (그림 2A) 전후 비교. 스택-z를, 후에 초점을 맞추고 "Z-스택" z-스택 옵션을 선택 하 고 애벌레 두뇌의 복 부 끝에 초점을 맞추고 후 낮은 제한 (클릭 "설정 처음" 버튼")를 설정 하 고 상한 (" 마지막 설정 "버튼을 클릭 하십시오.) 설정 탭 확장을 클릭 합니다 뇌의 등 쪽 대부분-표면입니다. Z-스택 이미지 수집을 실행 하려면 "실험 시작" 버튼 클릭.
- 63 X 객관적 렌즈 렌즈 리볼버를 수동으로 이동 하 여 선택 합니다.
- 피-형광 현미경 검사 법으로 전환, 수 녹지 보기의 중심에 눈에 의해 세포를 찾아 다음 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 다시가 서 "인수" 탭을 클릭 "찾기" 탭을 클릭 합니다.
- "수집 모드" 탭에서 256 x 256에 "" 프레임 크기를 설정 합니다. "라이브"를 클릭 하 고 관심의 뉴런을 관찰.
- 등 대부분 측면에서 starting 있는 녹지 수를 셀에 있는 초점 초점 비행기를 찾아.
- 작은, 원형 지역 "영역" 기능을 사용 하 여 관심 (ROI)의 영역으로 각 뉴런에 직경에서 1/3 정도 셀의 크기를 표시 합니다.
- 약 200 μ s/픽셀, 또는 200 µs/0.5 µ m의 레이저 면만 시간에 해당 하는 256 픽셀 (134.42 µ m x 134.42 µ m), x 13.93 s/256를 스캔 속도 설정 합니다. 또한, 4 반복을 설정 (' 반복 주기: 4'). 또는 충분 한 절제 달성 된다 그래야 수 반복 및 스캔 속도 최적화 합니다.
- 샘플 (전과 제거 후)와 '지역' (설정에 ROIs) 또는 해당 함수 (그림 1D) 사용 되는 소프트웨어에 이미지를 '시계열 (2 주기)'와 함께에서 박 리에 대 한 '표백' 기능을 수행 합니다.
- (절제) 전에 첫 번째 이미지와 시계열에서 (제거) 후 두 번째 이미지를 비교 하 여 주기, 그 배경 수준 (그림 2B)에서 관찰 대상된 세포 감소에 형광 표백 후 확인.
- 있으면 형광 여전히 절제 후, 반복의 수를 늘립니다.
- 다음, 초점면 약간 깊은 (즉, 복 부 쪽을 향해), 이동한 다음 초점 비행기 취소 연기나 셀 표시를 선택 합니다.
- (단계 1.9) 위에서 설명한 대로 표백 기능을 수행 합니다. 관심의 신경 구조에 있는 모든 세포는 되어 녹지까지이 단계를 반복 합니다.
- 연기나 수에 신경 구조를 다루는 모든 초점 비행기를 거쳐, 폐지 된 형광에 대 한 셀을 확인 합니다. 만약 일부 셀은 여전히 부족 한 절제로 인해 형광, 레이저-비추는 그들 다시 위에서 설명한 대로.
- 유 충 레이저 방사선 조사 후 agarose에서 복구 해야 하는 경우, 그것을 강제로 agarose 중이 유 충을 손상 할 수 있기 때문에 시도 하지 마십시오. 대신, 신중 하 게 할 작은 상처 유 충 주위 agarose에서 수직으로 신체의 표면에. 그런 다음 마 취 기운이 떨어지기 때 자체 agarose에서 수영 유 충을 기다립니다.
- 제거에 대 한 다음 유 충 이동 합니다 또는 조사 행동에 관여 하지 않은 뉴런의 다른 인구를 사용 하 여 제어 실험을 수행.
참고: 여기, 컨트롤, UAS:EGFP;에서 嗅 뉴런 gSAIzGFFM119B 유 충 레이저-녹지 (그림 2A, 오른쪽) 위에서 설명한 동일한 프로토콜을 사용 하 여 했다. - 몇 시간 또는 1 일 Ca 이미징 (제 2) 또는 행동 기록 (제 3)를 진행 하기 전에 복구에 대 한 허용. 이 복구 기간 동안, 애벌레 상태 (즉, 일반 자연 수영, 녹지 지역, 등명백한 열-손상)을 확인 하 고 가난한 건강의 흔적을 보여주는 하는 애벌레를 제거 합니다.
2. 칼슘 이미징 Pretectum 연기나 Zebrafish 애벌레에 먹이 갖는 신경 활동을 기록 하
- 준비는 녹음 실, 보안 씰 교 잡 챔버 가스 켓 유리 슬라이드에 접착 면이 유리에 놓고 최고 봉인 제거.
참고: 이것은 9 mm 직경에서 및 깊이 (그림 3A)에 0.8 m m는 작은 녹음 실을 만듭니다. - 다음, 나일론 메쉬를 배치 (개방의 크기: 32 µ m)을 자르면 아래 50 mL 튜브에. 모자를 사용 하 여 메쉬 튜브 (그림 3B)에 연결.
- Paramecia (이 데 사용할 시각적 자극으로 유 충 먹이)를 준비 합니다.
참고: Paramecium 문화 (2.3.1, 2.3.2 단계) 준비 미리.- 상용 소스 또는 학술 바이오 리소스 센터24 에서 paramecia 씨 문화를 사전에 얻을.
- 문화 압력가 쌀 밀 짚 및 건조 맥주 효 모22 (그림 3C)의 펠 릿을 포함 하는 물에 몇 일 동안 paramecium .
- 연속적으로 paramecium 문화 2 체를 통해 부 어 (150 µ m 조리개와 한 뒤 75 µ m 조리개와 다른) 문화에서 파편을 제거 하.
- 나일론 메쉬 (13 µ m 조리개)에 이전 단계에서 흐름 통해 paramecia 를 수집 합니다.
- 다시 시스템 물 (그림 3D)의 쥐 어 짜기 병을 사용 하 여 유리 비 커에 나일론 메쉬에 paramecia 를 일시 중단 합니다.
- (그림 3E) x 시스템 물 2에서에서 메쉬 (그림 3B) 린스.
참고: 이 단계의 목적은 현재 연구의 목표는 시각적으로 신경 활동을 구동 관찰로 모든 가능한 odorants 및 paramecium 문화 매체에 포함 된 tastants를 제거 하는 것입니다. - Anesthetize을 tricaine 솔루션에서 zebrafish 애벌레를 놓습니다.
- 2% 낮은 녹는점 agarose에 하나의 유 충을 탑재 합니다.
- 첫째, 전자 레인지 2% 낮은 녹는점 agarose 고는 agarose를 집중된 tricaine x 10의 1/10 볼륨을 추가 합니다.
- 녹음 실 (그림 3A)에 포함 하는 tricaine agarose의 한 방울을 배치 합니다.
- 확인 한 후는 agarose는 너무 뜨겁다, 즉시 제거 하는 어떤 과잉 agarose는 agarose의 표면 보이도록 약간 볼록 agarose (2.5 단계)에서 마 취 유 충을 넣습니다.
- 신속 하 게 방향을 지정 유 충으로 수직 위치 해 바늘 (그림 1C).
참고: 이 절차는 agarose 고형화 하기 전에 몇 초 이내에 완료 되어야 합니다. - 유 충은 제대로 위치 하 고, 일단 완전히 응고 agarose 위한 5 분 수 있습니다. 그런 다음는 agarose에 1 x tricaine 솔루션의 한 방울을 붓는 다.
- Zebrafish 유 충의 머리 주위 agarose를 제거 하 고 수술 칼을 사용 하 여 수영 paramecium 에 대 한 공간. 이렇게 하려면 먼저 확인 합니다 (그림 3F) agarose에서 몇 가지 작은 상처. 다음, 조심 스럽게 부드럽게 챔버에 시스템 물을 붓는 의해 초과 agarose를 제거.
참고: 이 단계에서는 tricaine 밖으로 세척 될 것 이다. - 다음으로, 시각적 자극으로 녹음 실에서 한 paramecium 를 넣어.
참고: Paramecium zebrafish 유 충의 머리 근처 수영 때 신경 응답을 (그림 3G)을 일 깨우 다 것 이다 그것. - 장소는 피 형광 현미경 녹음 실 과학 CMOS 카메라 (그림 3H)를 갖춘 고 2.5 X 목표 렌즈 (그림 3나)를 선택 합니다.
- 시간 경과 기록의 GCaMP 형광 신호를 수집 합니다.
- 갖춘 카메라용 이미지 수집 응용 프로그램을 시작 합니다.
- "시퀀스 창"을 클릭 하 고 창에서 "하드 디스크 기록"을 선택 합니다. 검색 설정 섹션에서 "프레임 카운트" 900 또는 어떤 다른 총 프레임 수를 원하는 설정 합니다.
참고: 가능한 경우, 시간 경과 기록 소프트웨어를 사용 하 여 모듈 함께 (여기, "하드 디스크 기록") 하드 드라이브에 데이터의 효율적인 저장을 가능 하 게. - "캡처" 창에서 x 2 사용 (즉, 33.3 fps), 30-ms와 Binning 2 노출 시간을 설정 합니다.
- 터치 패널을 제어 하는 현미경에는 GCaMP는 GFP 비슷한 여기/방출 스펙트럼 GFP, 설정 하는 필터를 선택 합니다.
- 카메라 보기 및 초점그림 4(A), 유 충을 찾은 다음 "라이브 중지"를 클릭 하 고 "시작" 버튼을 클릭 하 고 캡처 창에 "라이브"를 클릭 합니다. .Cxd 또는 인수 조건에 대 한 정보를 보유 하는 다른 형식의 동영상을 저장 합니다.
- 녹음 후 피지25무료 소프트웨어를 사용 하 여 시간 경과 영화에 두뇌 구조에 투자 수익에 대 한 평균 픽셀 값을 얻어서 GCaMP6s 형광 신호 (Ca 신호)를 분석 합니다.
참고: 피지는 많은 유용한 플러그에 ImageJ의 버전의 미리 설치 되어 있으며 바이오 형식과.cxd 형식 이미지 파일을 읽을 수 있는 플러그인. - 유 충 약간 녹음 하는 동안, 이동 하는 경우 피지에서26 TurboReg 플러그인 실행 하 여 이미지 등록을 수행 합니다. 메뉴에서 '플러그인', '등록' 및 'TurboReg'를 선택 합니다.
- 연구의 목적에 따라 데이터를 분석 하는 방법을 고려 하십시오. 다음 예입니다.
- 다음과 같이 F/F0 (형광 강도 각 시간에 나눈 나머지에 또는 어떤 Ca 과도 발생 전에 형광 강도)을 계산.
- pretectum 또는 투자 수익 관리자를 사용 하 여 ILH ROIs를 설정: 메뉴에서 "분석" "도구" "ROI 관리자" 선택 및 ROIs(그림 4)의 목록에 "추가".
- ROIs에 대 한 평균 픽셀 값을 계산 (즉,., GCaMP6s의 형광 강도) ROI 관리자 패널에서 선택 하 여: "더," "멀티 측정", 그리고 "확인." 스프레드시트 파일로 결과 저장 합니다.
- 신호는 시끄러운, 평균 11 시간-포인트 (이동 평균) 스프레드시트 데이터를 처리할 수 있는 응용 프로그램을 사용 하 여 신호.
- F0 F (시간이 지남에 형광 강도) 나누어 (기초 수준에서 형광 강도) 정규화 된 형광 강도 계산 하. 데이터 시각화의 예에서 변경 정규화 GCaMP6s 형광 강도 pretectum에는 ILH 색 이며 paramecium 궤도 (그림 4B-D)에 매핑됩니다.
3. 레이저 절제 다음 행동 결과의 평가
- 비디오 카메라를 갖춘 stereoscope 구성 된 행동 녹화 시스템을 설정 합니다. 카메라를 사용 하 여 한 적절 한 이미지 수집 소프트웨어, 상업적 또는 주문 품(그림 5).
- Paramecium 는 이미지 처리에 의해 검출 될 수 있다 조명 상태를 최적화. 예를 들어 공백 (그림 5B)와 링 백색 LED 빛을 사용 합니다.
참고: , 거리와 각도, LED의 샘플 (즉, 어두운 배경에서 밝은 또는 밝은 배경에서 어두운), 따라서, 성공적인 이미지 처리에 대 한 중요 한 모양에 영향을 줍니다. 스페이서 (그림 5C)의 최고 높이 결정 합니다. - 원래 최고 봉인 제거 (그림 5D)와 (는 유리 슬라이드에 연결 된) 행동 녹음 실에서 zebrafish 유 충 (섹션 1에 설명 된 레이저 제거 실험에서 발견)를 배치 합니다.
- 50 paramecia 문화 (단계 2.3.5)에서 수집는 micropipette 사용 하 고 녹음 실에서 그들을 배치.
- 녹음 실 위에 커버 슬립을 놓습니다. 물 작은 방울을 챔버에 공기를 도입 하지 않으려면 녹음 실의 물 표면에 배치 하기 전에 커버 슬립에 입었다.
참고: 이 단계에서 paramecia 와 물 녹음 실에서 오버플로될 것입니다. 녹음 실에서 paramecia 의 나머지 수는 약 30-40를 있을 것입니다. - (유 충 및 paramecia를 포함 하는) 녹음 실을 조명 시스템 (그림 5D)에 놓습니다.
- 11 분 (6, 600 프레임) 10 프레임에서 시간 경과 녹음을 시작 합니다.
- (선택 사항) 동작에 대 한 테스트는 유 충의 각에 대 한 형광 현미경 레이저-절제 (즉, 부재, 또는에서 크게 감소의 번호, 형광 세포의 효과 확인 하 여 레이저 연기나 영역의 형광을 관찰 레이저 방사선 영역)입니다.
참고: 방사선, 후에 일부 형광 세포 절제27후 분화 하는 셀에 Gal4 유전자 발현의 이상 증상으로 인하여 여전히 관찰할 수 있습니다. - 백그라운드에 균일의 부족에 대 한 보상을 유 충의 행동을 기록한 후 피지에서 평균 이미지에 의해 각 프레임의 픽셀에 의해 나눗셈을 수행: '과정', ' 이미지 계산기 ' 클릭 ' 작업: 나누기 ', ' 32 비트 (부동 소수점) 결과 ', 그리고 ' 확인 '. 평균 이미지 하려면, '이미지', '스택', ' Z', '평균 강도', 및 '확인' (그림 5E, F)을 클릭 합니다.
- 수 paramecia 의 수는 '분석', ' 분석 입자 '를 클릭 하 여 챔버에 남아 모든 paramecia를 포함 하는 지역 범위 설정 ' 쇼: 마스크 ' 확인란을 선택 하 고 '확인'을 클릭 하면. ' 쇼: 마스크 ' 옵션 추출 된 paramecia 이미지 (그림 5G), 각 프레임에서 입자 (paramecia)의 수의 목록을 제공할 것입니다.
- 시간이 지남에 따라 녹음 실에서 paramecia 왼쪽의 숫자를 플롯 합니다. Paramecia 의 수의 견적은 시끄러운 이기 때문에, 스프레드시트에 600 프레임 (1 분)의 범위에 있는 각 지점에 이동 평균을 수행 하는 것이 좋습니다.
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Representative Results
특정 뉴런 유전자 EGFP 또는 GCaMP6s, 누구의 식 Gal4 라인에서 주도 했다으로 표시 했다. Gal4 라인 gSAIzGFFM119B pretectal 지역 (magnocellular 표면 pretectal 핵), 및 후 각 전구 뉴런의 부분 모집단에 핵을 사용 되었다. 또 다른 Gal4 라인, hspGFFDMC76A에 ILH 레이블을 사용 되었다. 우리가 레이저-녹지 pretectal 신경 양측 (그림 2A 왼쪽된 패널)와 또한 연기나 신경 후 각 전구에 양측 Gal4 라인 gSAIzGFFM119B의 zebrafish 애벌레에는 컨트롤 (그림 2A 오른쪽 패널)로 UAS:EGFP 기자 물고기와 성관계를 했다. 결과 2 광자 레이저 하면서 인접 한 셀 또는 neurites 영향을 받지 않습니다 (그림 2B) 대상된 셀을 ablate 수 보여 줍니다.
Pretectal 신경에 ILH 향해 자신의 axons ipsilaterally 프로젝트. 여기, 우리가 그들의 기능적 연결 Ca 이미징 사용 하 여 조사. 이 지역에서 신경 활동 Ca 신호 Ca 프로브 GCaMP6s(그림 4),그 식 Gal4 라인 gSAIzGFFM119B에 의해 주도 되었다로 관찰 될 수 있다 (그림 4B) 또는 다른 Gal4 라인 hspGFFDMC76A (그림 4 C). 색된 화살표 (그림 4) 쇼 수영 방향 및 색으로 구분 된 Ca 신호 변화 뿐 아니라 paramecium, 궤도 지정 된 뇌 영역에서 수영 의 광경에 의해 evoked 했다 paramecium (그림 4B-D). Pretectum (그림 4B) 고 두 신경 활동은 시각적으로 구동 하는 것을 건의 하는 먹이의 근 위 존재에 ILH (그림 4C) 보였다 신경 활동.
이중 Gal4 GCaMP6s 애벌레 (gSAIzGFFM119B; hspGFFDMC76A;을 사용 하 여 UAShspzGCaMP6s), 우리는 pretectum에서 신경 활동과 연기나 애벌레에 ILH 관찰 하 pretectal 신경 일방적으로 고 추가 Ca 이미징 ablated. 레이저 연기나는 왼쪽된 pretectum 그 레이저 절제에 성공한 제안 아무 신경 활동 (그림 4D, 왼쪽 상단), 잔여 보였다. 그러나, 동측 ILH는 ILH 주요 입력 동측 pretectum에서 온다 제안 극적으로 감소 된 신경 활동 (왼쪽 아래그림 4D ) 보였다. 대조적으로, 레이저 녹지 pretectum (그림 4D 오른쪽 아래)의 반대편에 ILH 보였다 신경 활동 신경 활동에 비해 동측 pretectum (그림 4D, 오른쪽 상단)에 오른쪽 ILH 오른쪽 pretectum에서 입력을 받고 나왔다.
실험에 사용 하는 행동 분석 결과의 선택 조사 뉴런의 가능한 역할에 따라 다릅니다. 여기, 우리는 먹이 검출기21로 확인 되었다 pretectal 핵의 제거 다음 먹이 캡처 분석 결과의 예를 보여줍니다. 그림 5A-D에 표시 된 조명 시스템을 사용 하 여, 녹음 실에서 paramecium 의 수는 (그림 5E-G)을 처리 하는 이미지에 의해 계산 수 있습니다. 자동 눈, 추출 및 zebrafish 유 충의 눈이 조명 조건 (그림 5H에서에서 배경 보다 어두운 나타나므로 눈 위치 (즉, 눈의 각도에 변화)의 계산 가능한 수도 있습니다. ).
후 각 전구에 있는 신경 세포의 부분 모집단의 절제 하지 않은 동안 실험의 결과 양자-절제 (그림 5I, PT) pretectum 폐지 먹이 캡처 활동의 표시 (그림 5나, OB). 이러한 결과 그림 4에 나오는 실험 함께 제안 pretecto hypothalamic 회로 먹이 캡처 동작에 필수적입니다.
그림 1 . Zebrafish 애벌레. (A) 5 일 오래 된 (5 일 후 수정 (5-dpf)) 제 브라 유 충과 먹이, paramecium. (B) 4-dpf nacre 유 충 2% 낮은 녹는점 agarose에 포함. 참고 nacre 스트레인 망막 안료 상피는 그대로 시체에 검은 안료를 부족 합니다. 눈금 막대: 0.5 m m. (C) Dissecting 바늘 agarose에서 zebrafish 애벌레 방향을 사용. 눈금 막대: 1 cm. (D) 소프트웨어의 스크린샷 사용 두 광자 현미경에 절제에 사용 된 패널을 "표백", "시계열", 그리고 "영역"을 보여주는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 두 광자 레이저 현미경을 사용 하 여 신경 세포의 부분 모집단의 절제. (A) 4-dpf zebrafish 애벌레 전과 신경 절제 후의 EGFP 형광 이미지. 상위 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 3D 복원된 z-스택 이미지의 보기 및 사이드 보기. Z-스택 이미지는 20 X 렌즈와 함께 찍은. 녹지 지역 (pretectum 또는 후 각 전구) 노란색에서 동그라미는. 눈금 막대: 100 µ m. (B) "표백" 기능을 사용 하 여 단일 초점면에서 레이저 절제의 예. 레이저 방사선 영역 (ROIs로 설정)는 각 셀에 색상에 표시 됩니다. 눈금 막대: 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . Ca 이미징 zebrafish 애벌레와 paramecia 의 준비. (A) 녹음 실. 상업적으로 이용 가능한 9 m m 직경 0.8 m m 깊이 교 잡 가스 켓 8 챔버와 함께 x 기록 챔버로 이용 되었다. 개 스는 유리 슬라이드에 놓고 준수. 근육 위에 물개는 벗 겨. (B) paramecia린스에 사용 되는 나일론 메쉬 (32 µ m). 메시에 50 mL 튜브에 배치 했다. (C) Paramecium 포함 쌀 밀 짚 문화 및 효 모 펠 릿을 건조. (D) Paramecium 재고 솔루션 C. (E) Paramecium 재고 솔루션에 표시 된 문화에서 준비 되었다 매체에 가능한 후 각과 미각 신호를 제거 하려면 두 번 시스템 물으로 씻어 서. (F) Paramecium 녹음 실에 포함 된. Agarose의 부분을 제거, 여러 가지 상처 되었다. (G) 녹음 zebrafish 애벌레와 paramecium챔버. 대부분은 agarose의 수영 paramecium 수 있도록 제거 되었습니다. Zebrafish 유 충의 머리 노출 됩니다. (H) 직 립 형광 현미경 Ca 이미징에 사용. 현미경은 과학 CMOS 카메라를 갖추고 있습니다. (나) Zebrafish 여기에 가벼운 현미경 녹음 실에 있는 애벌레. 2.5 X 객관적 렌즈, 조명된 지역 챔버의 크기 보다 약간 큰입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 데이터를 이미징 대표 Ca. (A)는 pretectum와 더블 Gal4 hspGFFDMC76A;에서 노란색 동그라미 (ILH), 시상 하 부의 열 등 한 엽의 위치 gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s 제 브라 유 충입니다. Pretectum Ca 신호 (양측 평균), gSAIzGFFM119B;에서 paramecium 의 궤적에 매핑된 색 (B) 변경 UAShspzGCaMP6s 유 충입니다. 눈금 막대: hspGFFDMC76A;에서 paramecium 의 궤도에 매핑된 색 ILH Ca 신호 (양측 평균), 1 m m. (C) 변화 UAShspzGCaMP6s 유 충입니다. 눈금 막대: 1. (D)는 pretectum와 hspGFFDMC76A;에서 paramecium 의 궤도에 매핑된 색 ILH Ca 신호 변화 gSAIzGFFM119B; 왼쪽된 pretectum의 2 광자 레이저 절제를 받게 되었다 그 UAShspzGCaMP6s 유 충 눈금 막대: 1 m m. 이 이미지는 동일한에서 재현 했다 데이터 이전21에 게시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 캡처 분석 결과 및 대표 데이터 레이저 연기나 zebrafish 애벌레에 먹이. (A) 행동 녹화 시스템입니다. stereomicroscope CMOS 카메라로 갖춰 졌다. 이미지 맞춤 스크립트를 사용 하 여 인수 했다. 조명 시스템의 구성 요소 (B). 그레이 색 종이, 유리 기관총, 백색 LED 반지 빛, 기관총, 한 주문 품 스페이서 (골 판지)와 기관총 중심에 구멍 했다. (C) 조명 시스템 먹이 캡처 분석 결과 대 한 B. (D) 녹음 실에서 표시 된 부분에서 조립. 챔버 (직경: 20 m m, 깊이: 2.5 m m) 유리 슬라이드에 배치 되었다. 챔버의 원래 최고 봉인 벗 겨 했다. 커버 유리는 녹음 실에 지시 했다. (E) 기록된 영화의 프레임에서 Raw 이미지. (F) A 프레임 동영상에 평균 이미지 (픽셀-픽셀)를 나누어 됩니다. 참고 비 유니폼 배경 조명에이 이미지 처리에 의해 보상 될 수 있다. (G) Paramecia 피지에서 "입자 분석" 기능을 사용 하 여 프레임에서 추출. 피지에 적용 되는 임계값을 갖는 이미지의 (H) 예. 반면 zebrafish 유 충의 눈 어두운, 나타나고 배경은 회색 paramecia 밝은, 나타납니다. 필요한 경우에 눈 위치 (즉, 몸 축에 대해 각도)에 변화를 계산할 수 있습니다. (나) paramecium 소비 후 각 전구 연기나 제어 유 충 (산부인과)에 pretectum 연기나 애벌레 (PT)의 대표적인 실험 데이터. Pretectum 제거 嗅 절제 미치지 않았다 하는 동안 먹이 사냥 능력을 크게 감소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
두 광자 레이저는 구체적으로 개별 뉴런을 ablate을 우수한 공간 해상도, 위대한 주의 뇌 조직의 열 때문에 원치 않는 어떤 손상을 피하기 위하여 취해야 한다. 제거 실험에서 가장 중요 한 단계는 최적의 레이저 방사선 양을 결정 하는. 부족 한 방사선을 신경 세포를 죽 일 실패 합니다. 너무 많은 방사선 열 손상 주변 조직, 바람직하지 않은 효과가 발생할 것입니다 것입니다. 레이저 조사 (ROIs, 반복, 그리고 스캔 속도의 수의 분야)의 최적 범위는 좁은 것 처럼 보인다. 몇 가지 요소는 절제의 효율성을 영향을 줍니다.
첫째, 다른 형광 기자 단백질을 사용 하 여 제거 조건 각 기자에 대 한 최적화가 필요 합니다. GCaMP 식 핵 없는 세포질에서 관찰 됩니다. 반면, EGFP 형광 GCaMP에 비해 대상된 셀의 효율적이 고 특정 절제에 대 한 유리한 수 있습니다 셀의 내부에 걸쳐 나타납니다. GCaMP 사용 하 여도 레이저 녹지 GCaMP 표현 셀 줄된 형광 강도 EGFP 제거를 위해 사용 되었다 때 달리 즉각적인 대규모 Ca 유입으로 인하여 증가 형광 강도 전시할 수 있다 불리 한 이다. 따라서, 형광 변화 GCaMP와 절제의 넓이의 신뢰할 수 있는 지표를 수 없습니다. 이러한 경우 특정 기간 후 형광 세포의 감소를 관찰 하 여 제거를 확인 하기 위해 필요할 수 있습니다. 부재 또는 Ca 신호 녹지 지역에서의 상당한 감소 GCaMP와 성공적인 제거에 대 한 또 다른 표준은 될 수 있습니다.
둘째, 레이저 조사 성공적인 제거에 필요한 금액 (즉, 검사 속도, 검사의 반복 수)는 뇌의 표면에서 뉴런의 위치의 깊이 따라 달라질 수 있습니다. 뇌 안에 깊이 있는 더 많은 레이저 조사, 따라서, 그들을 ablate을 더 어렵게 필요 표면 부근 세포와 비교 합니다. 레이저 방사선 양을 최적화 뉴런의 각 타겟된 부분 모집단에 대 한 구체적으로 결정 되어야 합니다.
셋째, 경험적으로 그 설정 ROIs 수 한 검색에서 작은 영역에 자주 열 손상 뿐만 아니라 셀 주위 조직 관찰 되었다 (레이저 방사선 영역에서 거품의 모양으로 판단), 혼자, 또는 부족 한 셀을 대상으로 하는 반면 동일한 조건 하에서 스캔에 분산된 ROIs 해로운 효과 없 었 어 요. 현재 연구에서 표백에 적용 했다 작은 지역 (셀 바디 크기의 약 1/3)에 대상된 셀 외부 조직에 손상을 방지. 일반적으로 5-10의 세포는 각 초점 비행기 (4-8 비행기 전체 pretectal 영역을 커버)에 표적으로 했다.
레이저 방사선의 양을 최적화 하는 것 외에도 제어 실험을 수행 하 여 레이저 절제의 광범위 한 검증은 중요 합니다. 1 개의 제어 실험 공부 되 고 동작에 관여 될 가능성이 있지 않은 셀의 다른 부분 모집단의 레이저 절제를 포함할 수 있습니다. 嗅 신경 같은 Gal4 줄에 표시 된 현재 연구 (그림 2A, 오른쪽, 및 그림 5나) 제어 역임 했습니다. 그러나, 위에서 설명한 이유로, 신경 세포의 그룹이 없는 이상적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 뉴런의 각 부분 모집단 뇌, 세포 밀도, 형광 리포터 transgene 식 수준, 확산 속도 및 리포터 transgene 식의 타이밍에 그들의 위치에 관하여 다른 사람에서 다릅니다. 이러한 차이 절제 ('표백' 기능) 제어 실험에 대 한 정확한 동일한 설정을 사용 불가능 하 게. 따라서, 제어 실험의 종류 또한 고려 되어야, optokinetic 응답, 시각적 동작28및 운동21 기저 활동의 측정 등는 절제의 특정 효과 보장 하기 위해.
우리의 경험에서 수십 pretectal 세포의 제거는 양측, (agarose, 절제 2 광자 현미경을 사용 하 여 제거 후는 agarose에서 검색에 포함)에서 약 1 시간 걸립니다. 하루 최대 8 애벌레 (예를 들어, 실험 및 4 4 애벌레 제어) ablated 될 수 있다; 따라서, 실험의 세트의 몇 충분 한 애벌레는 실험적인 그룹에 대 한 보장 하기 위해 필요할 수 있습니다 (예를 들어, n = 12) 컨트롤 그룹에 대 한 (예를 들어, n = 12). 또한, 그것은 절반 하루 또는 하루 애벌레 제거 (예를 들어, 4-dpf 5-dpf, 또는 오후에 Ca 이미징 뒤 아침에 제거 행동 기록 뒤에 레이저 절제)에서 복구를 허용 하는 것이 좋습니다. 이 복구 기간 동안, 모든 병 모양의 애벌레 연구에서 제외 해야 합니다.
얻은 데이터를 분석 하는 데 사용 하는 프로토콜은 연구의 목적에 완전히 따라 달라 집니다. 현재 연구는 visual 필드에서 paramecium 의 위치는 pretectum에는 ILH 신경 활동 사이의 관계에 초점. 느린 감퇴를 고려 (~ 초) GCaMP6s 신호29, 증가, 감소의 타이밍만의 GCaMP6s의 신호 상관 paramecium의 위치. Paramecium 멀리 이동 하는 경우에 Ca 신호는 높을 수 있다. 따라서, 우리는 단지 데이터 프레 젠 테이 션에 GCaMP6s의 증가 형광 강도 포함. 이러한 유형의 분석은 종종 특정 프로그래밍 언어 또는 매크로 언어로 작성 된 맞춤 스크립트를 필요 합니다. 이 문서에 사용 된 스크립트는 요청 시 사용할 수 있습니다.
절제 된 상태 (즉, agarose 포함) 어느 정도; zebrafish 애벌레에 게 스트레스가 될 수도 있습니다. 그러나, 우리가 않았다 관찰 하지 명백한 스트레스 유발 신경 활동 또는이 조건에서 동작 free-swimming 조건21,22와 비교 하면. Agarose 임베디드 zebrafish 애벌레는 적어도 24 시간, (아마 더 많은 것) 어떤 명백한 문제 없이 살아남을 수 있습니다. Paramecium-구동된 Ca는 pretectum에서 신호 및 제한 조건에 ILH free-swimming 애벌레21에서 관찰 된 그 유사 했다. Zebrafish 시각적 동작 circadian 리듬에 의해 제어할 수 있습니다. 따라서, 우리는 저녁 늦은 무렵부터 행동 실험 실시. 야생 유형 및 제어 유 충이 녹화 시간 동안 paramecia 의 상당수를 소모.
여기서 설명 하는 기능 및 행동 분석 실험 많은 실험실에서 찾을 수 있다 또는 쉽게 설정할 수 있는 가장 일반적으로 사용 가능한 장비를 이용 하 고 따라서 그것은 행동 과학의 여러 분야에 광범위 한 응용 프로그램 있어야.
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Disclosures
저자 보고 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
이러한 연구는 문 부 과학성, JSP KAKENHI 보조금 번호 JP25290009, JP25650120, JP17K07494, 및 JP17H05984에서 받은 교부 금에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
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