Доклинические оценки отпорности противораковые кумарина OT48 сфероидов, колонии формирования анализов и ксенотрасплантатов данио рерио
Summary
Здесь мы представляем доклинические скрининг противораковые кумарины, с использованием 3D культуры и данио рерио.
Abstract
В пробирке и в естественных условиях доклинические скрининга новых терапевтических агентов являются важным инструментом обнаружения рака наркотиков. Хотя линий человеческих раковых клеток реагировать на терапевтические соединений в 2D (мерной) монослоя клеточных культур, чтобы понять эффективность препаратов в более физиологически соответствующих моделей были разработаны системы 3D культуры. В последние годы было отмечено парадигмы в доклинических исследованиях для проверки потенции новых молекул в 3D культуры системах, более точно имитирует микроокружения опухоли. Эти системы характеризуют состояние болезни более физиологически соответствующим образом и помочь получить более механистических постижения и понимания фармакологических потенции данной молекулы. Кроме того с текущей тенденцией в улучшении в естественных условиях модели рака, данио рерио стала важным позвоночных модель для оценки в естественных условиях образования опухоли и изучить влияние терапевтических агентов. Здесь, мы исследовали Терапевтическая эффективность hydroxycoumarin OT48 отдельно или в сочетании с BH3 mimetics в линии клеток рака легких A549 с помощью трех различных 3D культуры систем, включая колонии формирования анализов (CFA), сфероиде формирования пробирного (SFA) и в естественных условиях ксенотрасплантатов данио рерио.
Introduction
Рак вызывается клеточных мутаций и как следствие биохимических сигнальные пути разрушаются, вызывая неконтролируемому делению клеток и устойчивость к смерти клетки. Опухоли мешают физиологических функций пищеварительной, нервной, сердечно-сосудистой систем и впоследствии соседних тканей1. Несмотря на обширные исследования усилия рак остается наиболее распространенных опасных для жизни заболеваний в мире2. Прецизионные медицины была признана как основа будущего рака терапии. Новых молекулярных структур регулярно тестируются в сочетании с существующих препаратов для улучшения клинических результатов.
Однако одним из значительных ограничений, связанных с развитием новой эффективной целевой терапии является неспособность часто используемых анализов для имитации итоги точные биологические воздействия наркотиков3. Обнаружение рака наркотиков по-прежнему главным образом опирается на тестирования эффективности терапевтических агентов в рак клеточных линий культивировали в 2D монослоя культур, которые трудно проверить в клинических испытаниях4. Таким образом существует растущий интерес для разработки лучше модели рака, которые лучше имитировать родной особенностей опухоли в vivo5. В последние годы растущий интерес к модели 3D культуры привело к разработке усовершенствованных методик производить 3D опухоли модели5.
Здесь мы представляем подход с тремя культуры различных 3D клеточные технологии, позволяющие улучшить понимание потенции hydroxycoumarin OT486 в сочетании с mimetics BH3 раньше больше в глубину в vivo анализов. Наш метод состоит из сочетания колонии и ОТВС с в vivo опухоли формирования тест, основанный на zebrafish модель для дальнейшей проверки эффективности комбинации OT48 и BH3 mimetics в клетках рака легких и мониторинга прогрессии рака в живых организм.
Колонии формирования анализов обычно используются для оценки эффективности противоопухолевых агентов, как твердых, так и кроветворная рака. Assay определяет способность клетки размножаться бесконечно и формируют колонии7. Эффект противоопухолевых агентов на колонии, формирование способности клеток определяется снижение числа и/или размер колоний.
Сфероидов представляют в vitro модели опухоли и служить в качестве платформы лоу кост скрининга для противоопухолевых агентов. Сфероидов агрегаты клеток, растущих в суспензии или встроенные в матрице 3D. Такой подход широко используется для скрининга наркотиков и исследований опухолевого роста, распространение и иммунной взаимодействия8.
Чтобы полностью понять свойства нового препарата, важно проводить эксперименты в естественных условиях на грызунов. Однако этот обычных метод является дорогостоящим и трудоемким. В последние годы данио рерио (Danio рерио) стала широко изучены Лаборатория организма, что дешевле и быстрее, чтобы поднять. Опухоли разработан в подходе культура клеток представляют 3D данио рерио, но в рамках сотрудничества в vivo позвоночных9.
В общей сложности мы используем здесь три различных 3D культуры подходов, включая лигнин, ОТВС и данио рерио в естественных условиях образования опухоли продемонстрировать противоопухолевой потенциал hydroxycoumarin OT48 в легких Рак A549 клеток модели в сочетании с BH3 mimetics.
Protocol
Representative Results
Discussion
Темпы формирования колонии, полученные с MCBM, зависит от типа ячейки. Обычно для non сторонник клеток, количество колоний гораздо выше по сравнению с адэрентных клеток. Мы наблюдали, что клетки A549 образуется 30-40 колоний после 10 дней. Ранее мы сообщили для различных лейкозных клеток, что кол?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в СНС поддерживается национальной исследовательский фонд (СРН) MEST Корея опухоли микроокружения глобальной основной исследовательский центр (GCRC) Грант, [номер гранта 2011-0030001]; Национальный исследовательский грант университет Сеула и мозг Кореи (BK21) плюс программы.
Materials
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
Riferimenti
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
- Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).
