Prækliniske vurdering af Bioactivity af Anticancer cumarin OT48 af Spheroids, koloni dannelse Assays og zebrafisk Xenografts
Summary
Vi præsenterer her, præklinisk screening af anticancer coumariner ved hjælp af 3D kultur og zebrafisk.
Abstract
In vitro og i vivo præklinisk screening af nye terapeutiske agenter er et vigtigt redskab i kræft drug discovery. Selv om menneskelige cancer cellelinjer reagere terapeutiske forbindelser i 2D (dimensional) éncellelag cellekulturer, blev 3D kultur systemer udviklet for at forstå effekten af lægemidler i mere fysiologisk relevante modeller. I de seneste år, blev et paradigmeskift observeret i præ-klinisk forskning til at validere styrken af nye molekyler i 3D kultur systemer, mere præcist efterligne tumor mikromiljø. Disse systemer karakteriserer sygdommen stat i en mere fysiologisk relevante måde og bidrage til at få bedre mekanistiske indblik og forståelse af de farmakologiske potens af et bestemt molekyle. Desuden, med den nuværende tendens til forbedring i vivo kræftmodeller, zebrafisk fremstod som en vigtig hvirveldyr model til at vurdere, i vivo tumordannelse og studere effekten af terapeutiske agenter. Her, vi undersøgte den terapeutiske virkning af hydroxycoumarin OT48 alene eller i kombination med BH3 mimetics i lunge cancer cellelinie A549 ved hjælp af tre forskellige 3D kultur systemer herunder koloni dannelse assays (CFA), klumpformet dannelse assay (SFA) og i vivo zebrafisk xenografts.
Introduction
Kræft er forårsaget af cellulære mutationer og følgelig biokemiske signaling veje afbrydes udløser ukontrolleret celledeling og modstand til celledød. Tumorer forstyrre fysiologiske funktioner i fordøjelsessystemet, nervøs, kredsløbssystemet og efterfølgende omkringliggende væv1. Trods omfattende forskningsindsats, kræft er stadig den mest udbredte livstruende sygdom i verden2. Precision medicin er blevet anerkendt som grundlaget for fremtidige kræft therapeutics. Nye molekylære enheder testes rutinemæssigt i kombination med eksisterende stoffer for at forbedre kliniske udfald.
En af de betydelige begrænsninger i forbindelse med udviklingen af nye effektive målrettede behandlinger er imidlertid den manglende almindeligt anvendte assays til at simulere det nøjagtige biologiske resultatet af drug eksponering3. Kræft drug discovery er stadig for det meste afhængig teste effekten af terapeutiske agenter i kræft cellelinjer kulturperler i 2D éncellelag kulturer, som er vanskelige at validere i kliniske forsøg4. Derfor er der en stigende interesse i at udvikle bedre kræftmodeller, der bedre efterligner de indfødte funktioner af tumorer i vivo5. I de seneste år resulterede en stigende interesse i 3D kultur modeller i udviklingen af forbedrede metoder til at fremstille 3D tumor modeller5.
Her præsenterer vi en strategi med tre forskellige 3D celle kultur teknikker gør det muligt for at forbedre forståelsen af styrken af hydroxycoumarin OT486 i kombination med BH3 mimetics før mere i dybden i vivo assays. Vores metode består af kombinerer koloni og SFAs med en i vivo svulst dannelse test baseret på en zebrafisk model til yderligere validering af effekten af kombination af OT48 og BH3 mimetics i lunge kræftceller og overvåge kræft progression i en levende organisme.
Koloni dannelse assays er rutinemæssigt anvendes til at vurdere effekten af anticancer agenter for både solid såvel som hæmatopoietisk kræftformer. Analysen bestemmer evne til en celle for at formere sig på ubestemt tid og danne kolonier7. Effekten af anticancer agent på kolonidannende evne til celler bestemmes af fald i antallet og/eller størrelsen af kolonierne.
Spheroids repræsenterer in vitro- tumor modeller og tjene som en billig screening platform for anticancer agenter. Spheroids er aggregater af celler vokser i suspension eller indlejret i et 3D matrix. Denne tilgang er meget udbredt til stof screening og undersøgelser af tumor vækst, spredning og immun interaktion8.
Fuldt ud at forstå egenskaberne for et nyt lægemiddel, er det vigtigt at gennemføre i vivo forsøg på gnavere. Denne konventionelle metode er imidlertid dyrt og tidskrævende. I de seneste år blev zebrafisk (Danio rerio) et almindeligt studerede laboratorium organisme, der er billigere og hurtigere at rejse. Tumorer udviklet i zebrafisk repræsenterer en 3D celle kultur tilgang, men inden i vivo indstilling af en hvirveldyr9.
Helt, vi bruger her tre forskellige 3D kultur metoder herunder CFAs, SFAs og zebrafisk i vivo tumordannelse for at påvise kræft kapaciteten af hydroxycoumarin OT48 i en lunge cancer A549 celle model i kombination med BH3 mimetics.
Protocol
Representative Results
Discussion
Satserne for kolonien dannelse fremstillet med MCBM afhænger celletype. Normalt, for ikke-tilhænger celler, antallet af kolonier er meget højere i forhold til vedhængende celler. Vi observerede, at A549 celler dannet 30 til 40 kolonier efter 10 dage. Vi har tidligere rapporteret for forskellige leukæmiceller, antallet af kolonier er mellem 200-2509. Vores resultater viste, at OT48 alene ikke producere en betydelig nedgang i antallet af kolonier alene. Dog i kombination med BH3 blev mimetiske …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning på SNU understøttes af National Research Foundation (NRF) af MEST Korea for Tumor mikromiljø globale Core Research Center (GCRC) grant, [tilskud antal 2011-0030001]; ved Seoul National University Research Grant og hjernen Korea (BK21) PLUS program.
Materials
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
Riferimenti
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
- Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).
