Preklinisk utvärdering av bioaktiviteten av den mot cancer kumarin OT48 av Spheroids, koloni bildandet analyser och zebrafiskar xenograft
Summary
Här presenterar vi prekliniska screening av anticancer Kumariner använder 3D kultur och zebrafisk.
Abstract
In vitro och i vivo prekliniska screening av nya terapeutiska medel är ett viktigt verktyg i cancer drug discovery. Även om människors cancer cellinjer svara på terapeutiska föreningar i 2D (tvådimensionell) enskiktslager cellkulturer, har 3D kultur system utvecklats för att förstå effekten av läkemedel i mer fysiologiskt relevanta modeller. Under senare år observerades ett paradigmskifte i prekliniska forskning för att validera styrkan av nya molekyler i 3D kultur system, mer exakt härma den tumör mikromiljö. Dessa system karakterisera sjukdomstillstånd på ett mer fysiologiskt relevanta sätt och hjälpa till att få bättre mekanistisk insikt och förståelse för den farmakologiska potensen av en viss molekyl. Dessutom med den nuvarande trenden att förbättra in-vivo cancer modeller, zebrafisk har vuxit fram som ett viktigt ryggradsdjur modellerar att bedöma in-vivo tumörbildning och studera effekten av terapeutiska medel. Här, vi undersökte den terapeutiska effekten av hydroxycoumarin OT48 ensamt eller i kombination med BH3 mimetika i lung cancer cell fodrar A549 med hjälp av tre olika 3D kultur system inklusive kolonin bildandet analyser (CFA), sfäroid bildandet assay (SFA) och i vivo zebrafiskar xenograft.
Introduction
Cancer är orsakade av cellulär mutationer och följaktligen biokemiska signalvägar störs utlöser okontrollerad celldelning och motstånd till celldöd. Tumörer störa fysiologiska funktioner i matsmältningssystemet, nervsystemet, cirkulationssystem och därefter angränsande vävnader1. Trots omfattande forskningsinsatser fortfarande cancer den vanligaste livshotande sjukdomen i världen2. Precision medicin har erkänts som grunden för framtida cancer therapeutics. Nya molekylära enheter testas rutinmässigt i kombination med befintliga läkemedel för att förbättra kliniska resultat.
En av de betydande begränsningar som är associerade med utveckling av nya effektiva riktade terapier är dock vanliga analyser misslyckande att simulera exakta biologiska resultatet av drogen exponering3. Cancer läkemedelsutveckling bygger fortfarande mestadels på testa effekten av terapeutiska medel i cancer cellinjer odlade i 2D enskiktslager kulturer, som är svåra att validera i kliniska prövningar4. Därför finns det ett växande intresse att utveckla bättre cancer modeller som bättre efterliknar de inbyggda funktionerna i tumörer i vivo5. Under senare år resulterade ett ökande intresse för 3D kultur modeller i utvecklingen av förbättrade metoder att producera 3D tumör modeller5.
Här presenterar vi en strategi med tre olika 3D cell kultur tekniker gör det möjligt för att förbättra förståelsen av styrkan hos hydroxycoumarin OT486 i kombination med BH3 mimetika innan mer djup i vivo analyser. Vår metod består i att kombinera koloni och SFAs med en in-vivo tumör bildandet test utifrån en zebrafisk modellen att validera effekten av kombinationen av OT48 och BH3 mimetika i lungcancerceller och övervaka cancer progression i en levande organismen.
Kolonin bildandet analyser används rutinmässigt bedöma effekten av cytostatika för såväl fast som hematopoetisk cancer. Analysen avgör förmågan hos en cell att föröka på obestämd tid och bilda kolonier7. Effekten av en anticancer agent på den kolonibildande cellernas förmåga bestäms av minskning av antalet och/eller storleken på kolonierna.
Spheroids representerar i vitro tumör modeller och fungera som en låga kostnader screening plattform för cytostatika. Spheroids är aggregat av celler som växer i suspension eller inbäddade i en 3D matrix. Denna metod används ofta för drogkontroll och studier av tumör tillväxt, spridning och immun interaktion8.
För att fullt förstå egenskaperna för ett nytt läkemedel, är det viktigt att utföra in-vivo -experiment på gnagare. Konventionella metoden är dock dyrt och tidskrävande. Under de senaste åren blev zebrafiskar (Danio rerio) en allmänt studerade laboratorium organism som är billigare och snabbare att höja. Tumörer utvecklas i metoden zebrafiskar representerar en 3D cell kultur men inom inställningen in vivo av en vertebrate9.
Sammantaget använder vi här tre olika 3D kultur metoder inklusive CFAs, SFAs och zebrafiskar i vivo tumörbildning för att demonstrera mot cancer kapaciteten hos hydroxycoumarin OT48 i en lung cancer A549 cell modell i kombination med BH3 mimetika.
Protocol
Representative Results
Discussion
Av kolonin bildandet erhålls med MCBM beror på vilken cell. Vanligtvis, för icke-anhängare celler, antalet kolonier är mycket högre jämfört med vidhäftande celler. Vi observerade att A549 celler bildas 30 till 40 kolonier efter 10 dagar. Vi har tidigare rapporterat för olika leukemiceller att antalet kolonier är mellan 200 till 2509. Våra resultat visade att OT48 ensam inte producerar en betydande minskning av antalet kolonier ensam. Men i kombination med BH3 reducerades mimetiska A121…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning vid SNU stöds av den nationella Research Foundation (NRF) av Koreas MEST för tumör mikromiljö Global Core Research Center (GCRC) bidrag, [grant nummer 2011-0030001]; genom den Seoul National University forskningsbidrag och hjärnan Korea (BK21) PLUS program.
Materials
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
Riferimenti
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
- Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).
