Preklinik antikanser Coumarin OT48 pulcuklarının, koloni oluşumu deneyleri ve zebra balığı Xenografts Bioactivity değerlendirilmesi
Summary
Burada, antikanser coumarins 3D kültür ve zebra balığı kullanarak preklinik tarama mevcut.
Abstract
Roman terapötik ajanlar içinde in vitro ve in vivo önceden klinik tarama çoğu kanser ilaç keşif önemli bir araçtır. Her ne kadar insan kanser hücre hatları 2D (boyutlu) monolayer hücre kültürlerinde terapötik bileşiklerin yanıt, 3D kültür sistemleri daha fizyolojik ilgili modelleri ilaçların etkinliğini anlamak için geliştirilmiştir. Son yıllarda, daha doğrusu tümör microenvironment taklit eden 3D kültür sistemlerinde yeni moleküller potens doğrulamak için önceden klinik araştırma bir paradigma kayması gözlendi. Bu sistemler daha fizyolojik ilgili bir şekilde hastalık durumu karakterize ve daha iyi mekanik kavrama ve belirli bir molekül farmakolojik potens anlayış kazanmak için yardım. Ayrıca, in vivo kanser modelleri iyileştirilmesinde mevcut trendi ile zebra balığı vivo içinde tümör oluşumu değerlendirmek ve terapötik ajanlar etkisini incelemek için önemli bir omurgalı model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, biz Hidroksikumarin OT48 tedavi edici etkinliği tek başına veya akciğer kanseri hücre kültürünü A549 BH3 mimetics ile birlikte koloni oluşumu deneyleri (CFA), küresel oluşumu tahlil (SFA) dahil olmak üzere üç farklı 3D kültür sistemleri kullanarak araştırdık ve vivo zebra balığı xenografts.
Introduction
Kanser tarafından hücresel mutasyonlar neden olur ve sonuç olarak biyokimyasal sinyal yolları kontrolsüz hücre bölünmesi ve hücre ölümü direnç tetikleyen bozdu. Tümörleri sindirim, sinir, dolaşım sistemi ve daha sonra komşu dokulara1fizyolojik fonksiyonları müdahale. Kapsamlı bir araştırma, kanser dünya2‘ deki en yaygın hayatı tehdit eden hastalık imlere rağmen. Hassas tıp gelecekteki kanser tedavi temel olarak kabul edilmiştir. Yeni moleküler varlıklar klinik sonuç geliştirmek için mevcut uyuşturucu ile birlikte düzenli olarak test edilir.
Ancak, yeni verimli hedefli tedaviler gelişimi ile ilişkili önemli kısıtlamalar uyuşturucu pozlama3tam biyolojik sonucu benzetimini yapmak için yaygın olarak kullanılan deneyleri başarısızlığın biridir. Kanser ilaç keşif hala çoğunlukla terapötik ajanlar etkinliğinin klinik4‘ te doğrulamak zor olan 2D monolayer kültürde kültürlü kanser hücre hatlarında test dayanır. Bu nedenle, daha iyi taklit tümörler vivo içinde5yerel özelliklerini daha iyi kanser modelleri geliştirmek için büyüyen bir ilgi vardır. Son yıllarda, 3D kültür modelleri artan bir ilgi 3D tümör modelleri5üretmek için geliştirilmiş yöntemleri geliştirmede sonuçlandı.
Burada, bir yaklaşım içinde derinlik vivo deneyleri daha önce BH3 mimetics ile birlikte OT486 Hidroksikumarin potens anlayış geliştirmek için izin üç farklı 3D hücre kültürü teknikleri ile mevcut. Daha fazla akciğer kanser hücrelerini OT48 ve BH3 mimetics arada etkinliğini doğrulamak ve kanser bir yaşam ilerlemesinde izlemek için bir zebra balığı modelini temel bir vivo içinde tümör oluşumu testi ile koloni ve SFAs birleştirerek bizim Yöntem oluşur organizma.
Koloni oluşumu deneyleri düzenli olarak hem katı hem de hematopoetik kanserler için antikanser ajanların etkinliğini değerlendirmek için kullanılır. Tahlil süresiz olarak çoğalırlar ve koloniler7oluşturmak için hücre yeteneğini belirler. Antikanser Ajan etkisi yetenek hücre oluşturan colony sayısı azalması ve/veya koloniler boyutunu tarafından belirlenir.
Pulcuklarının vitro tümör modelleri temsil ve antikanser maddeleri için bir düşük maliyetli tarama platform olarak hizmet. Pulcuklarının süspansiyon büyüyen hücresi ya da 3D dizey içinde gömülü. Bu yaklaşım yaygın uyuşturucu tarama ve tümör büyüme, yayılmasını önleme ve bağışıklık etkileşim8çalışmalar için kullanılır.
Tamamen yeni bir ilaç özelliklerini anlamak için in vivo deneyler kemirgenler üzerinde esastır. Ancak, geleneksel bu yöntem pahalı ve zaman alıcı. Son yıllarda, zebra balığı (Danio rerio) daha ucuz ve daha hızlı yükseltmek için yaygın olarak okudu laboratuvar organizma oldu. Tümör zebra balığı temsil bir 3D hücre kültür yaklaşımda ama içinde vivo ayarındaki omurgalı9geliştirdi.
Tamamen, biz burada Hidroksikumarin OT48 BH3 mimetics ile birlikte bir akciğer kanseri A549 hücre modelindeki antikanser kapasitesini göstermek için CFAs, SFAs ve zebra balığı vivo içinde tümör oluşumu da dahil olmak üzere üç farklı 3D kültür yaklaşımları kullanın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Koloni oluşumu MCBM ile elde edilen oranda hücre türüne bağlıdır. Genellikle, yapışık olmayan hücreler için koloni sayısı çok daha yüksek yapisan hücrelere karşılaştırılır. A549 hücreleri 10 gün sonra 30-40 kolonileri oluşturduğu görülmektedir. Daha önce farklı lösemi hücreleri için kolonileri sayısının 200-2509arasında olduğunu bildirdin. Sonuçlarımız OT48 yalnız kolonileri yalnız sayısı önemli bir azalma getirmedi gösterdi. Ancak, BH3 ile birlikte …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SNU Araştırma Kore MEST tümör Microenvironment küresel çekirdek Araştırma Merkezi (GCRC) Bursu, [grant numarası 2011-0030001]; tarafından Ulusal Araştırma Vakfı (NMG) tarafından desteklenmektedir Seul Ulusal Üniversitesi Araştırma Bursu ve beyin Kore (BK21) tarafından program artı.
Materials
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
Riferimenti
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
- Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).
