Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung
Summary
Hier präsentieren wir Protokolle für sammeln und microinjecting precellular westlichen Mais Maiswurzelbohrer Embryonen zum Zwecke der Ausführung der funktionellen Genomik Assays wie Keimbahn Transformation und CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung.
Abstract
Der Maiswurzelbohrer (WCR) ist ein wichtiger Schädling von Mais und ist bekannt für seine Fähigkeit, schnell zu Pest Managementstrategien anzupassen. RNA-Interferenz (RNAi) erwies sich ein leistungsfähiges Werkzeug für WCR Biologie zu studieren, hat aber seine Grenzen. Speziell, RNAi selbst vergänglich ist (d. h. nicht zu langfristigen Mendelian Erbschaft des zugehörigen Phänotyps), und es erfordert eine Kenntnis der DNA-Sequenz des Zielgens. Letzteres kann die Begrenzung wenn der Phänotyp des Interesses von schlecht erhaltenen oder auch neuartigen Genen gesteuert wird weil er einfach nur nützliche Ziele schwierig sein würde, wenn nicht gar unmöglich. Daher sollte die Anzahl der Werkzeuge in WCRs genomische Toolbox durch die Entwicklung von Methoden, die verwendet werden könnte, um stabile mutierte Stämme erstellen und aktivieren Sequenz-unabhängige Umfragen des Genoms WCR erweitert werden. Hier zeigen wir die Methoden zum Erfassen und microinject precellular WCR Embryonen mit Nukleinsäuren verwendet. Während die hier beschriebenen Protokolle auf die Schaffung von transgenen WCR ausgerichtet sind, könnte CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung auch mit durchgeführt werden die gleichen Protokolle mit dem einzigen Unterschied, die Zusammensetzung der Lösung in die Embryonen injiziert.
Introduction
Maiswurzelbohrer (WCR), Diabrotica Virgifera Virgifera, ist ein wichtiger Schädling von Mais1. Interessanterweise scheint WCR Überwindung Kontrolle Maßnahmen schneller als die meisten landwirtschaftlichen Schädlinge, da sie nicht nur physiologisch sondern auch verhaltensorientierte2,3,4,5, anpassen 6. im letzten Jahrzehnt RNA-Interferenz (RNAi), ein leistungsfähiges funktionelle Genomik Werkzeug, wurde als eine mögliche Steuerungsmethode für WCR7,8untersucht, und wurde auch als Mittel verwendet, um gen Funktion9zu studieren. Während RNAi durch Mikroinjektion von doppelsträngige RNA (DsRNA) bei anderen Spezies häufig durchgeführt wird, ist jedoch Injektion basierende RNAi in WCR selten. In der Tat gibt es nur wenige Berichte über RNAi per Mikroinjektion von DsRNA in WCR9. Der Grund ist, dass WCR auch erlaubt das Studium der embryonalen Effekte durch die Fütterung von DsRNA der Mutter11High-Level der Gen Knockdown über Einnahme von DsRNA7,10, erreichen kann. Während diese Methode eine ausgezeichnete Thema für funktionelle Genomanalyse über RNAi WCR macht, hat es Fortschritte bei der Entwicklung von Methoden zur embryonalen Mikroinjektion in dieser Spezies verlangsamt.
Trotz der Macht der RNAi gibt es ein paar Nachteile. Zum Beispiel reagieren nicht alle Gene gleich auf RNAi. Diese Variabilität kann Interpretation der Ergebnisse eines funktionellen Genomik-Assays schwieriger machen. Auch, RNAi ist flüchtig und löst keine vererbbare Mutationen. Auf der anderen Seite erzeugen Keimbahn Transformation, eine weitere funktionelle genomische Tool, vererbbare Mutationen über Einfügung eines markierten Elements übertragbar in das Genom12,13. Dies macht Keimbahn Transformation ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Erstellung von mutierte Stämme für den Einsatz in genetischen Langzeitstudien. Transformation kann auch verwendet werden, um eine Mutation zu retten, durch die Bereitstellung einer funktionsfähige Kopie des Gens für eine mutierte Genom-14. Darüber hinaus ist die Keimbahn Transformation der Grundstein für eine Vielzahl von molekulargenetischer. Neben ausschlagen und/oder Rettung Genfunktion, Germline Veränderung Enhancer Trapping15, Gene Trapping16, Gal4-basierte ektopische Expression17und genomweite Mutagenese18einsetzbar.
Vor kurzem wurden Tools, mit denen anspruchsvolle Genom-Bearbeitung entwickelt. Zu diesen Tools zählen Transkription Activator-Like Effektor Nukleasen (TALEN) und die CRISPR/Cas9-Nuklease System19,20. Der Vorteil dieser neuen Werkzeuge ist, dass sie Forscher die Fähigkeit, eine doppelsträngige DNA Pause an fast jedem Ort in fast jedem Genom zu induzieren. Sobald induziert, diese Pausen können repariert werden, durch nicht-homologe Enden verbinden, die Deletionen oder Insertionen in das gezielte gen einführen kann, oder durch Homologie gerichtete Reparatur, die in der Gegenwart ein veränderter Konstrukt, katalysieren kann die Ersatz des gesamten Gene oder genetische Regionen21,22. Diese Methoden erfordern jedoch Mikroinjektion von DNA, RNA und Protein zu sehr jungen Embryonen.
Wichtig ist, überschreiten nicht anders als die DsRNAs verwendet für RNAi, Nukleinsäuren und Proteine zur Keimbahn Transformation und Genom-Bearbeitung leicht Zellmembranen. Daher muss Mikroinjektion von Plasmid-DNA, mRNAs und/oder Proteine statt in der syncytial Blastoderm Phase (d. h. vor der Insekten Embryo cellularizes). Dadurch wird dem Zeitpunkt der Injektionen einen kritischen Faktor. Zum Beispiel in Drosophila Melanogastermüssen Embryonen injiziert werden, innerhalb von zwei Stunden nach Ei12zu legen. Daher muss Entwicklung eines erfolgreichen embryonalen Mikroinjektion Protokolls für WCR die besten Voraussetzungen für weibliche Eiablage, sowie die beste Methode zum Sammeln von precellular Embryonen in ausreichender Menge berücksichtigen.
Dem Bemühen, eine Vielzahl von molekularen genetischen Werkzeuge auf WCR Biologie zu bringen erfordert Methoden zum Sammeln und microinjecting precellular WCR Embryonen entwickeln. Hier bieten wir Ihnen eine ausführliche Anleitung, zusammen mit Tipps und Tricks, um anderen Transformation-basierte Techniken WCR Forschung verwendet zu helfen. Diese Techniken ermöglichen neben der Verlängerung transgener Technologies, WCR für funktionelle Genomforschung Studien, auch leistungsstarke neue Bekämpfungsstrategien wie gen Fahrt23,24 in diesem wirtschaftlich bedeutenden getestet werden Schädling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl Mikroinjektion des WCR mit DsRNAs zum Zwecke der RNAi gemeldeten9wurde, dies ist das erste Protokoll, best Practices für microinjecting precellular WCR Embryonen, ein kritischer Prozess für die Durchführung von Keimbahn Transformation zu etablieren und/oder CRISPR/Cas9 Genom Bearbeitung in dieser Art. Erfolgreiche Mikroinjektion WCR Embryonen ist abhängig von vielen Faktoren ab, wie transformationseffizienz. Nachfolgend sind einige der wichtigsten Fragen das Ergebnis unter Verwendung di…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Forschungsprogramm von Monsanto Mais Maiswurzelbohrer wissen, MDL aus NCSU Nummer AG/1005 (, MDL und YC) und Startkapital gewähren. Gewähren Sie FC wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Monsantos Mais Maiswurzelbohrer wissen Research Program (AG/1005) und der National Science Foundation, Nummer MCB-1244772 (MDL). Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt. FC und MDL konzipiert und gestaltet die Experimente; FC, PW und SP durchgeführt die Experimente; FC und MDL analysiert die Ergebnisse; und FC, NG und MDL schrieb das Manuskript. Teresa O’Leary, William Klobasa und Stephanie Gorski danken wir für ihre kompetente Unterstützung in screening-WCR. Wir danken Dr. Wade French (USDA-ARS, North Central Agricultural Research Laboratory, Brookings, SD) für Sendungen von Eiern, Lab Kolonien und die Aufzucht Protokolle zu etablieren.
Materials
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5×7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
Riferimenti
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