Mikroskop västra havren Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryon för könsceller omvandling eller CRISPR/Cas9 gen editering
Summary
Här presenterar vi protokoll för att samla och microinjecting precellular västra havren rootworm embryon i syfte att utföra funktionella-genomiska analyser såsom könsceller omvandling och CRISPR/Cas9-gen editering.
Abstract
Den västra havren rootworm (VCT) är en viktig skadegörare på majs och är välkänt för sin förmåga att snabbt anpassa sig till pest förvaltningsstrategier. RNA-interferens (RNAi) har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att studera WCR biologi, har men sina begränsningar. Specifikt, RNAi själv är övergående (dvs inte resulterar i långsiktiga Mendelian arv av den associera fenotypen), och det kräver att veta DNA sekvensen av målgenen. Det senare kan vara begränsande om fenotypen av intresse styrs av dåligt bevarade, eller ens nya gener, eftersom att identifiera användbara mål skulle vara en utmaning, om inte omöjligt. Därför bör antalet verktyg i WCRS genomisk verktygslåda utökas genom utveckling av metoder som kan användas för att skapa stabila mutant stammar och aktivera sekvens-oberoende undersökningar av WCR genomet. Häri, detalj vi de metoder som används för att samla och microinject precellular WCR embryon med nukleinsyror. Medan de protokoll som beskrivs häri syftar till skapandet av transgena WCR, kunde CRISPR/Cas9-gen editering också utföras med samma protokoll, med den enda skillnaden är sammansättningen av lösningen injiceras i embryon.
Introduction
Den västra havren rootworm (VCT), Diabrotica virgifera virgifera, är en viktig skadegörare på majs1. Intressant, WCR visas att övervinna kontroll mäter snabbare än mest jordbruks skadedjur eftersom de inte bara anpassa sig fysiologiskt men också behaviorally2,3,4,5, 6. under det senaste årtiondet, RNA-interferens (RNAi), ett kraftfullt funktionella genomisk verktyg, har undersökts som en potentiell kontrollmetod för WCR7,8, och har också använts som ett sätt för att studera gen funktion9. Men medan RNAi utförs ofta av Mikroskop av dubbelsträngat RNA (dsRNA) i andra arter, är injektion-baserade RNAi sällsynt i WCR. I själva verket finns det endast ett fåtal rapporter av RNAi via Mikroskop av dsRNA till WCR9. Anledningen är att WCR kan uppnå hög-nivåer av genen knockdown via intag av dsRNA7,10, även tillåter studier av embryonala effekter av utfodring dsRNA mor11. Även denna metod gör WCR ett utmärkt ämne för funktionell genomanalys via RNAi, har det avtagit framsteg i utvecklingen av metoder för embryonala Mikroskop hos denna art.
Trots kraften av RNAi finns det några nackdelar. Till exempel svara inte alla gener lika på RNAi. Denna variation kan göra tolkningen av resultaten av en funktionell genomik assay svårare. Även RNAi är övergående och genererar inte ärftliga mutationer. Däremot, kan könsceller omvandling, en annan funktionell genomisk redskap, generera ärftliga mutationer via införandet av ett markerat överförbara element i genomet12,13. Detta gör könsceller omvandling ett utmärkt verktyg för att skapa mutant stammar för användning i långsiktiga genetiska studier. Omvandling kan också användas för att rädda en mutation genom att leverera en fungerande kopia av genen till en mutant genomet14. Dessutom är könsceller omvandling hörnstenen i en mängd olika molekylära genetiska tekniker. Förutom att slå ut eller undsättning geners funktion, kan könsceller omvandling användas för enhancer svällning15, gen svällning16, Gal4-baserade ektopisk uttryck17och genome-wide mutagenes18.
Mer nyligen, verktyg som möjliggör avancerad editering har utvecklats. Dessa verktyg inkluderar transkription Activator-Like effektor nukleaser (TALEN) och CRISPR/Cas9-nuclease system19,20. Fördelen med dessa nya verktyg är att de erbjuder forskare förmågan att inducera en dubbelsträngat DNA paus på nästan vilken plats som helst inom nästan alla genomet. När inducerad, dessa pauser kan repareras genom icke-homolog ände att gå, som kan presentera borttagningar eller infogningar i riktade genen, eller genom homologi-regisserad reparation, som i närvaro av en konstruerad konstruktion, kan katalysera den byte av hela gener eller genetiska regioner21,22. Dessa metoder kräver dock Mikroskop av DNA, RNA och/eller protein i mycket unga embryon.
Enkelt ännu viktigare, till skillnad från den dsRNAs som används för RNAi, nukleinsyror och proteiner som används för könsceller omvandling och editering inte kan passera cellmembran. Mikroskop för kontrollplasmid-DNA, mRNA eller proteiner måste därför äga rum under syncytial blastoderm scenen (dvs innan insekten embryot cellularizes). Detta gör tidpunkten för injektioner en kritisk faktor. Till exempel i Drosophila melanogastermåste embryon injiceras inom två timmar efter ägg lekmanna-12. Därför måste utvecklingen av en framgångsrik embryonal Mikroskop protokoll för WCR beakta de bästa förutsättningarna för kvinnliga äggläggning, samt den bästa metoden för att samla in tillräckliga mängder precellular embryon.
Ett försök att få ett brett utbud av molekylära genetiska verktyg på WCR biologi kräver utveckla metoder för att samla och microinjecting precellular WCR embryon. Här tillhandahåller vi detaljerade instruktioner, tillsammans med tips och tricks, hjälpa andra att använda transformation-baserade tekniker på WCR forskning. Förutom att utvidga transgena tekniker till WCR för användning i funktionella genetiska studier, aktivera dessa tekniker även kraftfulla nya pest control strategier såsom gen enhet23,24 ska testas i denna ekonomiskt viktiga Pest.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fastän Mikroskop av WCR med dsRNAs i syfte att RNAi har varit rapporterade9, detta är det första protokollet att fastställa bästa praxis för microinjecting precellular WCR embryon, en kritisk process för att genomföra könsceller omvandling och/eller CRISPR/Cas9 genomet redigering i denna art. Framgångsrika Mikroskop WCR embryon är beroende av många faktorer, liksom omvandling effektivitet. Diskuteras nedan är några av de stora frågorna påverkar resultatet av användning av detta pr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av ett bidrag från Monsanto havren Rootworm kunskap forskningsprogrammet, bevilja nummer AG/1005 (till MDL och YC) och nystartade fonder till MDL från NCSU. FC stöddes av bidrag från Monsanto havren Rootworm kunskap forskningsprogram (AG/1005) och National Science Foundation, bevilja nummer MCB-1244772 (MDL). Författarna förklarar inget konkurrerande intressen. FC och MDL avlad och utformade experiment; FC, PW och SP utfört experimenten; FC och MDL analyseras resultaten. och FC, NG och MDL skrev manuskriptet. Vi tackar Teresa O’Leary, William Klobasa och Stephanie Gorski för deras experthjälp i screening WCR. Vi tackar också Dr. Wade French (USDA-ARS, North Central jordbruks Research Laboratory, Brookings, SD) för transporter av ägg att fastställa lab kolonier och tillhandahålla uppfödning protokoll.
Materials
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5×7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
Riferimenti
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm. PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).
- Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice. Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).
- Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides. Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).
- Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. . Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , (1959).
- Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).
- Baum, J. A., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).
- Velez, A. M., et al. Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Genes (Basel). 8 (1), (2016).
- Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. J Insect Sci. 10, 162 (2010).
- Rangasamy, M., Siegfried, B. D. Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults. Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).
- Khajuria, C., et al. Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).
- Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements. Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).
- Robertson, H. M., et al. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetica. 118 (3), 461-470 (1988).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes. Science. 218 (4570), 341-347 (1982).
- O’Kane, C. J., Gehring, W. J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).
- Lukacsovich, T., et al. Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster. Genetica. 157 (2), 727-742 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics. Genetica. 163 (2), 647-661 (2003).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetica. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Jeggo, P. A. DNA breakage and repair. Adv Genet. 38, 185-218 (1998).
- Gantz, V. M., Bier, E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).
- Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).
- Chu, F., et al. Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Insect Mol Biol. , (2017).
- Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions. Cell. 21 (3), 669-679 (1980).
- Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
- Branson, T. The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).
- Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).
- Handler, A. M., James, A. A. . Insect transgenesis: methods and applications. , (2000).
- Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids. Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).
- Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5, 11 (2007).
- Horn, C., Wimmer, E. A. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management. Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).
