Uso di elettroforesi del Gel di agarosio detergente semi-denaturante dimensionale due per confermare dimensioni eterogeneità delle fibre amiloidi o amiloide-come

Summary

Qui usiamo l'elettroforesi del gel dell'agarosi semi-denaturante bidimensionale per confermare la presenza di amiloide-come le fibre di dimensioni eterogenee ed escludere la possibilità che l'eterogeneità di dimensioni è dovuto dissociazione delle fibre amiloidi durante il gel processo in esecuzione.

Abstract

Fibre amiloidi o amiloide-come sono stati associati con molte malattie umane e ora stanno scoprende sarà importante per molte vie di segnalazione. La capacità di rilevare prontamente la formazione di queste fibre nelle varie circostanze sperimentali è essenziale per capire la loro funzione potenziale. Molti metodi sono stati utilizzati per rilevare le fibre, ma non senza alcuni inconvenienti. Ad esempio, la microscopia elettronica (EM), o colorazione con rosso Congo o Thioflavin T spesso richiede purificazione delle fibre. D'altra parte, elettroforesi su gel di agarosio detergente semi-denaturante (SDD-età) permette la rilevazione delle fibre amiloide-come SDS-resistente in estratti delle cellule senza purificazione. Inoltre, permette il confronto tra la differenza di dimensioni delle fibre. Ancora più importante, può essere utilizzato per identificare le proteine specifiche nelle fibre mediante Western blotting. È molto meno tempo e più facilmente accessibile a un più ampio numero di laboratori. SDD-età risultati mostrano spesso variabile grado di eterogeneità. Solleva la questione se parte dell'eterogeneità deriva dalla dissociazione della proteina complessa durante l'elettroforesi in presenza di SDS. Per questo motivo, abbiamo impiegato una seconda dimensione di SDD-età per determinare se l'eterogeneità di dimensioni visto in SDD-età è davvero un risultato di fibra eterogeneità in vivo e non il risultato di degradazione o di dissociazione di alcune delle proteine elettroforesi. Questo metodo permette la veloce, qualitativa conferma che le fibre amiloidi o amiloide-come non sono parzialmente dissociando durante il processo di SDD-età.

Introduction

La formazione di fibre amiloidi a causa di misfolding proteico a lungo è stata conosciuta per svolgere un ruolo in condizioni patologiche come il morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson e la malattia di Huntington¹. Più recentemente, la formazione di fibre amiloidi o amiloide-come è stata indicata per essere una parte delle vie di segnalazione in esseri umani, compreso durante la risposta immunitaria innata anti-virale² e necroptosis^3,4e negli organismi inferiori come lievito^5,6. Pertanto, la capacità di r....

Protocol

1. preparare i campioni

1. Amiloide di cultura 2 x 10⁶ producendo le cellule di cancro del colon HT-29 in un piatto di coltura del tessuto 10 cm in 10 mL di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale e penicillina-streptomicina. Cellule di coltura durante la notte in un incubatore a 37 ° C con 5% CO₂.
   1. Dopo che le cellule crescono per 80% confluency, lavare le cellule con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS). Aggiungere 3 mL di soluzione di tripsina e incubare a 37 ° C per 3 min.
   2. Dopo che le cellule sono totalmente dissociate dal piatto, aggiungere 10 mL di terreno di coltura e trasferire l....

Results

Dopo induzione di necroptosis, RIPK1 e RIPK3 hanno mostrato amiloide-come i modelli quasi identici (corsie 2 e 4, Figura 1). Tuttavia, MLKL fibre erano più eterogenei e sembravano di essere più piccolo di fibre di RIPK1/RIPK3 (corsia 6, Figura 1). Che li ha spinti a sviluppare il metodo 2D SDD-età per affrontare la possibilità se MLKL forma fibre di RIPK1/RIPK3-indipendente o MLKL semplicemente si dissocia da grandi fibre di RIPK.......

Discussion

L'aspetto più critico della 2D SDD-età è che le condizioni di elettroforesi sono gli stessi per la prima e la seconda dimensione. La capacità di rilevare una forte linea diagonale a 45° (che indica che non si è verificato nessun dissociazione o degradazione) dipende le fibre la migrazione in maniera identica sia durante electrophoreses. Utilizzando diverse condizioni, ad esempio cambiando la tensione o la lunghezza della fase di esecuzione, nasconderanno questi risultati. Inoltre, come è il caso per tradizionale 1D SDD-e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
unità di elettroforesi su gel	Fisher	HE99XPRO	appratus per la corsa su gel.
agrose	VWR	97062-250	Per gel di agarosio.
torre di carta	Fisher	19-120-2484	per il trasferimento di
carta da filtro	VWR	21427-386	per il trasferimento di
membrana PVDF	Bio-Rad	162-0177	per il trasferimento di
latte in polvere bloccante	Bio-Rad	1706404XTU	per il blocco in Western blot
Anticorpo MLKL	Genetex	GTX107538	anticorpo MLKL di coniglio
Anticorpo RIPK1	BD Biosciences	610459	anticorpo anti-RIPK1 del topo
Anticorpo RIPK3	regalo dal Dr. Xiaodong Wang		coniglio anti-RIPK3. Vedi riferimento 11.
anticorpo secondario anti-Coniglio-HRP	Sigma	A6154
ECL	Fisher	WBKLS0500	substrato HRP chemiluminescente occidentale
Pellicola radiografica	Fisher	F-BX810	per il risultato del Western blot
DMEM	Sigma	D6429	per colture cellulari
Siero fetale bovino	Sigma	F4135	per coltura cellulare
penicilina-streptomicina	Sigma	P4333	per colture cellulari
Soluzione di tripsina	Sigma	T4049	per colture cellulari
PBS per colture tissutali	Sigma	D8662	per colture cellulari
TNF ricombinante	prodotto nel nostro laboratorio		per indurre la necroptosi. Vedere il riferimento 11.
dono smac-mimetico	del Dr. Xiaodong Wang		per indurre la necroptosi. Vedere il riferimento 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	per l'induzione della necroptosi. Vedere il riferimento 11.
Contacellule	Bio-Rad	1450102	Modello TC20; per conteggio cellule
Pierce™ Kit per il dosaggio delle proteine BCA	Thermo Scientific	23225	per la misurazione della concentrazione proteica nei lisati cellulari
Cell lifter	Fisher	07-200-364	per rimuovere le cellule dalla piastra
Tampone di lisi (1 L)20			mL 1 M Tris pH 7,4 10 mL glicerolo 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (inibitori della proteasi e dei fosfati a piacere)
10X TAE (1 L)			48,4 g Tris base 11,42 mL acido acetico glaciale 20 mL 0,5M EDTA pH 8 ddH20 a 1 L 4X
SDD-AGE tampone di carico (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL glicerolo 4 mL 20% SDS 0,5 mL 10% blu di bromofenolo 31 mL ddH2O
TBS Tampone di trasferimento (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7,4 30 mL 5 mL NaCl 950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4· 2H2O 24 g KH2PO4 aggiungere ddH2O a 10 L