Bruk av to-dimensjonale semi denaturing vaskemiddel Agarose Gel geleelektroforese å bekrefte størrelse heterogenitet av Amyloid eller Amyloid-lignende fiber
Summary
Her bruker vi todimensjonal semi denaturing agarose gel geleelektroforese å bekrefte tilstedeværelse av amyloid-lignende fiber av heterogene størrelse og utelukke muligheten for at størrelse heterogenitet skyldes dissosiasjon av amyloid fibrene under gel prosess.
Abstract
Amyloid eller amyloid-lignende fiber har vært forbundet med mange menneskelige sykdommer, og nå blir oppdaget å være viktig for mange signalveier. Evnen å lett oppdage dannelsen av disse fiber under ulike eksperimentelle forhold er avgjørende for å forstå deres potensielle funksjon. Mange metoder brukes til å oppdage fibrene, men ikke uten noen ulemper. Elektronmikroskop (EM) eller flekker med Kongo rød eller Thioflavin T ofte krever for eksempel rensing av fibrene. På den annen side, tillater semi denaturing vaskemiddel agarose gel geleelektroforese (SDD-alder) påvisning av SDS bestandig amyloid-lignende fiber i cellen ekstrakter uten rensing. I tillegg kan det sammenligning av størrelsen forskjellen av fibrene. Enda viktigere, kan den brukes til å identifisere spesifikke proteiner i fiber av vestlige blotting. Det er mindre tidkrevende og lettere tilgjengelig for et større antall labs. SDD-alder resultater viser ofte variabel graden av heterogenitet. Det reiser spørsmål om en del av heterogenitet resultat av protein kompleks under geleelektroforese i nærvær av SDS. Derfor har vi brukt en andre dimensjonen av SDD-alder for å avgjøre om den størrelse heterogenitet sett i SDD-alder er virkelig et resultat av fiber heterogenitet i vivo og ikke et resultat av nedbrytning eller av noen av proteiner under geleelektroforese. Denne metoden gir rask, kvalitativ bekreftelse på at amyloid eller amyloid-lignende fiber ikke er delvis dissociating under av SDD-alder.
Introduction
Dannelsen av amyloid fiber på grunn av protein misfolding har lenge vært kjent å spille en rolle i patologisk forhold som Alzheimers og Parkinsons sykdom Huntingtons sykdom1. Nylig har dannelsen av amyloid eller amyloid-lignende fiber vist seg å være en del av signalveier mennesker, inkludert anti-viral medfødte immunforsvaret2 og necroptosis3,4, og lavere organismer som gjær5,6. Derfor er muligheten til å oppdage disse fibrene i laboratoriet viktig. Foreløpig det er tre hovedmåter å oppdage amyloid og amyloid-lignende fiber: bruk av fargestoffer, EM og SDD-alder.
Bruk av fargestoffer, som Kongo rød eller Thioflavin T, tilbyr fordelen av å rask og lett synlig bruker mikroskopi eller spektroskopi7. Oppdagelsen av mikroskopi, ved Kongo rød, gir imidlertid ingen spesifisitet som proteiner utgjør fiber eller størrelsen på fiber. Tilsvarende gir bruk av spektroskopi å oppdage Kongo rød eller Thioflavin T binding til protein komplekser bare et positivt eller negativt resultat.
EM gir bevis for tilstedeværelsen av fiber og kvantitativ informasjon om fiber lengde og diameter8. Denne metoden krever imidlertid svært strenge rensing. I tillegg er EM en spesialisert teknikk som bruker dyrt utstyr.
SDD-alder har blitt brukt til å oppdage SDS bestandig mega Dalton protein komplekser inkludert amyloid eller amyloid-lignende fiber. Det gir mange fordeler. Først det krever ikke rensing av fiber og er lett å peform9. For det andre gir kvalitativ informasjon om størrelsen av fiber, inkludert relative størrelsen og mengde fiber heterogenicity. Til slutt, fordi vestlige blotting kan utføres etter geleelektroforese, er det lett å oppdage tilstedeværelsen av et protein som finnes et antistoff, selv om det bør bemerkes at ettersom SDD-alder semi denaturing, noen epitopes kan forbli skjult som kompliserer påvisning av antistoff.
Nylig reseptor samspill protein kinase 1 (RIPK1) og 3 (RIPK3) har blitt rapportert til skjemaet amyloid fibre som signaliserer plattformer under necroptosis, en programmert form for nekrose3. Mens han studerte disse fiber, viste vår lab at en annen necroptosis-assosiert protein, blandet herkomst kinase domene-lignende (MLKL), også dannet amyloid-lignende fiber4. Imidlertid ved undersøkelse med SDD-alder var størrelsen på MLKL fibrene forskjellig fra RIPK1 og RIPK3 fiber, som dukket opp identiske med hverandre (figur 1). Dette var uventet fordi det er kjent at MLKL binder til RIPK1/RIPK3 å danne necroptosis signalene kompleks kalt necrosome10.
Det er minst to forklaringer. Først to helt forskjellige amyloid-lignende fiber kan danne under necroptosis, én med RIPK1/RIPK3 og den andre som inneholder MLKL. Andre er bare én type amyloid-lignende fiber med RIPK1/RIPK3/MLKL kan dannes under necroptosis, men association of MLKL med andre proteiner svak nok som det dissosierer under SDD-alder.
For å løse dette, foreslår vi utfører en todimensjonal (2D) SDD-alder. SDD-år-stabile amyloid eller amyloid-lignende fiber vil ha samme migrasjon mønster under første og andre dimensjon-geleelektroforese. Dette vil være synlig etter overføring proteiner til en membran og gjennomføre en Western blot. Stabil fiber har en skarp skrå. Eventuelle avvik fra dette foreslår at fibrene gjennomgå endringer på grunn av SDS-geleelektroforese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det viktigste aspektet av 2D SDD-alder er at de geleelektroforese betingelsene er de samme for første og andre dimensjonen. Muligheten til å oppdage en skarp diagonal linje i 45° (indikerer at ingen dissosiasjon eller degradering oppstod) avhenger av fiber migrering i en identisk måte under begge electrophoreses. Bruke ulike forhold, for eksempel endre spenning eller hvor kjøretid vil skjule disse resultatene. Også, som er tilfellet for tradisjonelle 1D SDD-alderen, kokende prøven bør unngås, som dette vil forst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet av et fellesskap for sh-A. fra NIH/NCATS (TL1TR001104), en Welch Foundation gir (I-1827) og en R01 grant fra NIGMS (RGM120502A) å Z.W. Z.W. er Virginia Murchison Linthicum forskeren i medisinsk forskning og kreftforebygging og Research Institute av Texas Scholar (R1222).
Materials
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
- Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
- Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. . Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
