Использование двух мерных полу денатурируя стирального геля агарозы подтвердить размер неоднородность волокон амилоида или амилоид как
Summary
Здесь мы используем двумерных полу денатурируя геля агарозы для подтверждения наличия волокон амилоида как гетерогенной размера и исключить возможность того, что размер неоднородность является диссоциации волокон амилоида при гель Запуск процесса.
Abstract
Амилоида или амилоид как волокна были связаны с многих заболеваний человека и теперь обнаруживаются имеет важное значение для многих сигнальных путей. Способность легко обнаруживать формирования этих волокон различных экспериментальных условиях существенно важное значение для понимания их потенциальные функции. Многие методы были использованы для обнаружения волокна, но не без некоторых недостатков. К примеру электронной микроскопии (EM), или окрашивание с Конго красный или Тиофлавин Т часто требует очистки волокон. С другой стороны, полу денатурируя стиральный порошок очки геля агарозы (SDD-возраст) позволяет обнаруживать SDS-устойчивостью волокон амилоида как в клеточных экстрактов без очистки. Кроме того он позволяет Сравнение размера разницы волокон. Что еще более важно она может использоваться для выявления специфических белков внутри волокон, Западный blotting. Это менее затратным по времени и более доступными для более широкого числа лабораторий. SDD-возраст результаты часто показывают переменной степени неоднородности. Это поднимает вопрос, ли частью неоднородность результатов от диссоциация комплекса во время электрофорез SDS в присутствии белка. По этой причине мы использовали второй аспект SDD-возраста, чтобы определить размер неоднородность, видели в SDD-возраст действительно результат волокна гетерогенность в естественных условиях и не в результате деградации или диссоциации некоторых белков во время электрофорез. Этот метод позволяет быстрый, качественный подтверждение, что волокон амилоида или амилоид как не отделения частично во время процесса SDD-возраста.
Introduction
Формировании амилоидных волокон благодаря сворачиванию белков уже давно известен играть определенную роль в патологических условиях, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона1. Совсем недавно формирования волокон амилоида или амилоид как было показано, быть частью сигнальных путей в организме человека, в том числе во время анти-вирусные врожденный иммунный ответ2 и necroptosis3,4и в нижней организмов такие дрожжи5,6. Таким образом способность обнаруживать эти волокна в лаборатории имеет важное значение. В настоящее время, существует три основных способа для обнаружения амилоид и волокон амилоида как: использование красителей, EM и SDD-возраста.
Использование красителей, таких как красный Конго или Тиофлавин Т, предлагает преимущество быстро и легко обнаружить с помощью микроскопии и спектроскопии7. Однако обнаружение по микроскопии, в случае Конго красный, обеспечивает не специфика, о котором белки составляют волокна, или размер волокон. Аналогично использование спектроскопии для обнаружения Конго красный или Тиофлавин Т привязки белковых комплексов обеспечивает только положительный или отрицательный результат.
ЕТ предоставляет убедительные доказательства наличия волокон, а также количественной информации о волокна длиной и диаметром8. Однако этот метод требует очень строгие очистки. Кроме того EM-это специализированная техника, которая использует дорогостоящего оборудования.
SDD-возраст был использован для обнаружения SDS-устойчивостью мега Далтон белковых комплексов, включая амилоида или амилоид как волокна. Она имеет много преимуществ. Во-первых он не требует очистки волокон и легко peform9. Во-вторых она обеспечивает качественную информацию о размере волокон, включая относительный размер и количество волокна heterogenicity. И наконец потому что Западный blotting может выполняться после электрофореза, это легко обнаружить присутствие любого белка, для которого есть антитела, хотя следует отметить, что потому что SDD-возраст полу денатурируя, некоторые epitopes могут оставаться скрытым который усложняет обнаружение антителом.
Недавно формы волокон амилоида поступало рецептор взаимодействующих киназу 1 (RIPK1) и 3 (RIPK3) в качестве сигнализации платформ во время necroptosis, форму запрограммированного некроза3. Изучая эти волокна, наши лаборатории показали, что другой necroptosis связанные белком, смешанные линии киназы домена как (MLKL), также формируется амилоид как волокна4. Однако после осмотра с SDD-возраст, размер MLKL волокон появился отличаются от RIPK1 и RIPK3 волокон, которые появились идентичны друг к другу (рис. 1). Это было неожиданным, потому что хорошо известно, что MLKL привязан к RIPK1/RIPK3, сформировать necroptosis сигнализации комплекс под названием necrosome10.
Существует по крайней мере два объяснения. Во-первых два совершенно различных волокон амилоида как может образоваться во время necroptosis, один содержащие RIPK1/RIPK3 и других содержащих MLKL. Во-вторых только один тип волокон амилоида как, содержащие RIPK1/RIPK3/MLKL может образовываться при necroptosis, но Ассоциация MLKL с другими белками является достаточно слабый, которые он разъединяет эпоху SDD.
Для решения этой проблемы, мы предлагаем выполнение двухмерный (2D) SDD-возраст. Амилоид SDD-возраст stable или волокон амилоида как будут иметь один и тот же шаблон миграции во время первой и второй аспект электрофореза. Это будет обнаружить после передачи белки мембраны и проведении западную помарку. Стабильные волокна представят резкий диагональной последовательности. Любое отклонение от этого хотел бы предложить, что волокна претерпевают изменения вследствие SDS-электрофорез.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важным аспектом SDD эпохи-2D является, что электрофорез условия одинаковы для первого и второго измерения. Способность обнаруживать, что резкий диагональной линии под углом 45 ° (показывая, что произошла не диссоциации или деградации) зависит от волокна, миграции идентичным образ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается стипендий для с.х.-A. из низ/NCATS (TL1TR001104) Фонд Уэлч Грант (I-1827), и R01 грант от NIGMS (RGM120502A) к Z.W. Z.W. — Вирджиния Мерчисон Linthicum ученый в медицинских исследований и профилактики рака и исследований Института Техас ученый (R1222).
Materials
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
- Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
- Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. . Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
