Användning av två dimensionell semi denatureringen tvättmedel agaros Gel Electrophoresis bekräfta storlek heterogenitet av Amyloid eller Amyloid-liknande fibrer
Summary
Här använder vi tvådimensionell semi denatureringen agaros gel-elektrofores att bekräfta förekomsten av amyloid-liknande fibrer av heterogena storlek och utesluta att storlek heterogenitet är på grund av dissociation av amyloid fibrerna under gelen process som körs.
Abstract
Amyloid eller amyloid-liknande fibrer har förknippats med många sjukdomar, och nu upptäcks vara viktigt för många signalvägar. Förmågan att lätt upptäcka bildandet av dessa fibrer olika experimentella villkor är viktigt för att förstå deras potentiella funktion. Många metoder har använts för att upptäcka fibrerna, men inte utan vissa nackdelar. Elektronmikroskopi (EM) eller färgning med kongorött eller Thioflavin T ofta kräver exempelvis rening av fibrerna. Däremot, tillåter semi denatureringen tvättmedel agaros gel-elektrofores (SDD-ålder) identifiering av SDS-resistenta amyloid-liknande fibrer i cell extrakt utan rening. Det kan dessutom jämförelse av storlek skillnaden av fibrerna. Viktigare, kan det användas för att identifiera specifika proteiner inom fibrerna av Western blotting. Det är mindre tidskrävande och mer lättillgänglig för ett större antal labs. SDD-ålder resultaten visar ofta varierande grad av heterogenitet. Det väcker frågan om en del av heterogenitet resultat från dissociationen av protein komplex under elektrofores i närvaro av SDS. Av denna anledning har vi anställt en andra dimension SDD-ålder för att avgöra om storlek heterogenitet sett i SDD-AGE är verkligen ett resultat av fiber heterogenitet i vivo och inte ett resultat av antingen nedbrytning eller dissociation av några av proteinerna under elektrofores. Denna metod tillåter snabb, kvalitativ bekräftelse på att amyloid eller amyloid-liknande fibrerna inte delvis separera under processen SDD-ålder.
Introduction
Bildningen av amyloid fibrer på grund av protein Skellefteåsjukan har länge varit känt att spela en roll vid patologiska tillstånd som Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom och Huntingtons sjukdom1. Mer nyligen, bildningen av amyloid eller amyloid-liknande fibrer har visat sig vara en del av signalvägar i människor, inklusive under anti-virala medfödda immunsvar2 och necroptosis3,4, och i lägre organismer till exempel jäst5,6. Därför är förmågan att upptäcka dessa fibrer i labbet viktigt. För närvarande finns det tre sätt att upptäcka amyloid och amyloid-liknande fibrer: användning av färgämnen, EM och SDD-ålder.
Användning av färgämnen, såsom kongorött eller Tioflavin T, erbjuder fördelen av att vara snabb och lätt påvisbara använder antingen mikroskopi eller spektroskopi7. Påvisande genom mikroskopi, när det gäller kongorött, ger dock ingen specificitet som proteiner består av fibrer, eller storleken av fibrerna. Likaså ger användningen av spektroskopi att upptäcka kongorött eller Thioflavin T bindning till proteinkomplex endast ett positivt eller negativt resultat.
EM ger avgörande bevis för förekomsten av fibrer och också kvantitativ information om fiber längd och diameter8. Denna metod kräver dock mycket stränga rening. EM är dessutom en specialiserad teknik som använder dyr utrustning.
SDD-ålder har använts för att upptäcka SDS-resistenta mega Dalton proteinkomplex inklusive amyloid eller amyloid-liknande fibrer. Det erbjuder många fördelar. Först, det kräver inte rening av fibrer och är lätt att peform9. För det andra, det ger kvalitativ information om storleken av fibrerna, inklusive relativa storlek och mängden fiber heterogenicity. Slutligen, eftersom Western blotting kan utföras efter elektrofores, är det lätt att upptäcka förekomsten av något protein som det är en antikropp, även om det bör noteras att eftersom SDD-ålder är semi denatureringen, vissa epitoper kan förbli dolda som komplicerar detektering av antikroppar.
Nyligen, receptor samverkande proteinkinas 1 (RIPK1) och 3 (RIPK3) har rapporterats att bilda amyloid fibrer som signalering plattformar under necroptosis, en programmerad form av nekros3. Medan du studerar dessa fibrer, visade vårt labb att en annan necroptosis-associerade protein, blandade härstamning kinase domän-liknande (MLKL), också bildade amyloid-liknande fibrer4. Emellertid vid undersökning med SDD-ålder verkade storleken på MLKL fibrerna skiljer sig från RIPK1 och RIPK3 fibrerna, som dök upp identiska med varandra (figur 1). Detta var oväntat eftersom det är välkänt att MLKL binder till RIPK1/RIPK3 att bilda den necroptosis signalering komplex kallas de necrosome10.
Det finns minst två förklaringar. Först två helt åtskilda amyloid-liknande fibrer kan bilda under necroptosis, en som innehåller RIPK1/RIPK3 och den andra som innehåller MLKL. Andra, endast en typ av amyloid-liknande fibrer innehållande RIPK1/RIPK3/MLKL kan bildas under necroptosis, men kopplingen mellan MLKL och de andra proteinerna är svaga nog som det separerar under SDD-åldern.
För att åtgärda detta, föreslår vi utför en tvådimensionell (2D) SDD-ålder. SDD-ålder-stabil amyloid eller amyloid-liknande fibrer har samma migration mönster under den första och andra dimension elektrofores. Detta kommer att upptäckas efter överföra proteinerna till ett membran och genomföra en Western blot. Stabil fibrer kommer att ställa ut en skarp diagonalt mönster. Varje avvikelse från detta skulle föreslå att fibrerna genomgår förändringar på grund av den SDS-elektrofores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mest kritiska aspekten av 2D SDD-ålder är att villkor som elektrofores är samma för den första och den andra dimensionen. Förmågan att upptäcka en skarp diagonal linje vid 45° (indikerar att ingen dissociation eller nedbrytning har inträffat) beror på de fibrer som migrerar på ett identiskt sätt under båda electrophoreses. Med hjälp av olika villkor, till exempel att ändra spänning eller längden på körning kommer att skymma dessa resultat. Också, som är fallet för traditionella 1D SDD-ålder, k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av en gemenskap för S.H.-A. från NIH/NCATS (TL1TR001104), en Welch-Stiftelsen beviljar (I-1827), och en R01 bidrag från NIGMS (RGM120502A) att Z.W. Z.W. är den Virginia Murchison Linthicum forskare i medicinsk forskning och förebyggande av Cancer och forskning institutet av Texas Scholar (R1222).
Materials
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
- Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
- Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. . Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
