Джин целевой случайных мутагенеза выбрать дестабилизирующих гетерохроматин протеасом мутантов в деления дрожжевой
Summary
Эта статья описывает подробная методология для случайных мутагенеза целевого гена в деления дрожжей. В качестве примера мы нацелены на rpt4 +, которая кодирует Субблок 19S протеасомы, и экран для мутации, которые дестабилизируют гетерохроматина.
Abstract
Случайные мутагенеза целевого гена обычно используется для выявления мутаций, которые дают желаемого фенотип. Из методов, которые могут быть использованы для достижения случайных мутагенеза, ошибкам ПЦР является удобной и эффективной стратегии для генерации совокупность разнообразных мутантов (т.е., мутант библиотека). Ошибкам ПЦР является методом выбора, когда исследователь стремится мутировать предопределенных региона, например кодирвоания гена оставляя других регионах геномной не влияет. После того, как мутант библиотека усиливается ошибкам ПЦР, это должны клонироваться в подходящей плазмиду. Размер библиотеки, генерируемых ошибок ПЦР ограничивается эффективность клонирования шаг. Однако в деления дрожжи, Делящиеся дрожжи, клонирования шаг можно заменить с помощью высокоэффективных Одношаговая фьюжн ПЦР для создания конструкций для преобразования. Мутанты желаемый фенотипы могут быть выбраны с помощью соответствующих журналистам. Здесь мы опишем эту стратегию в деталях, взяв в качестве примера, репортер, вставляются в прицентромерного гетерохроматина.
Introduction
Форвард генетика является классическим методом, в котором исследователи стремятся естественным мутантов, которые отображают особое фенотип и генетического анализа. В обратной генетики мутации вводятся в ген интереса и изучены фенотипа. В последнем случае случайные мутагенеза целевого гена часто используется для создания пула мутантов, которые впоследствии выбраны для желаемый фенотипы, такие как чувствительность температуры или изменены ферментативную активность. Различные методы могут использоваться для достижения случайных мутагенеза, включая ошибкам ПЦР1; УФ облучения2; Химические мутагены, таких как этиловый метансульфонат (EMS) или азотистой кислоты3; использование временных мутатора штаммов, например чрезмерной выражая mutD5 4; и5Перетасовка ДНК.
Здесь мы описываем реверс генетика стратегия, в которой мы используем ошибкам ПЦР для создания мутантных бассейны для целевых генов в деления дрожжей. Как один догадаться из названия, этот метод создает мутаций, умышленно внося ошибки во время ПЦР. В отличие от других методов мутагенеза ошибкам ПЦР позволяет пользователю определять области, чтобы быть mutagenized. Это делает его особенно полезным в усилия для изучения функции белка/домена интерес.
Для демонстрации этой процедуры случайного мутагенеза, мы здесь использовать rpt4 +, которая кодирует Субблок 19S протеасомы, в качестве примера. Rpt4 было показано, что Протеолиз независимые функции в организмах Кроме деления дрожжевой6,,78,9, и дефект в протеолиза может вызвать косвенные эффекты изменяя белки уровнях. Мы, таким образом, для мутантов, которые вызвали протеолиза независимые изменения, с целью изучения функции протеасомы на гетерохроматина.
Ошибкам ПЦР может применяться к любому региону гена, настроив расположение, в котором праймеры привязки. Мутантов, которые демонстрируют желаемого фенотипические изменения могут быть идентифицированы с соответствующим журналистам. Здесь, мы использовали ade6 + репортер вставлены в центромер 1 внешний Повторите региона (otr)10. Учредительный гетерохроматин формируется в этом регионе11, поэтому ade6 + репортер замолчать в состоянии дикого типа; Это обозначается красным колоний10. Мутации, что дестабилизирует учредительного гетерохроматин на центромер приведет к выражению ade6 + репортер, который визуализируется как белых колоний.
Protocol
Representative Results
Discussion
Случайные мутагенеза через ошибкам ПЦР является мощным инструментом для создания разнообразных пул мутантов в данном регионе. Этот метод особенно полезен для исследований, которые стремятся оценивать функцию белка при конкретных обстоятельствах. Например мы здесь используется ошиб?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансовую поддержку для этого проекта была представлена базовая программа исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством науки и ИКТ (2016R1A2B2006354).
Materials
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
References
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Cohen, J. How DNA shuffling works. Science. 293 (5528), 237 (2001).
- Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078 (2016).
- Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
- Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).
- Grewal, S. I., Jia, S. Heterochromatin revisited. Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).
- Forsburg, S. L. . Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , (2011).
- . . QIAquick PCR Purification Kit. , (2013).
- . . pBlueScript II Vector. , (2005).
- . . QIAquick Gel Extraction Kit. , (2013).
- . . QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , (2016).
- . . PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , (2004).
- . . Gibson Assembly Master Mix. , (2017).
- . . GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , (2012).
- . . Plasmid Plus Midi Kit. , (1999).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
- Nurse, P. . Fission Yeast Handbook. , (2000).
- Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
- Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).
- Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
- Wilson, D. S., Keefe, A. D. Random mutagenesis by PCR. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
