Gene targeting mutagenesi casuale per selezionare eterocromatina-destabilizzare Proteasome mutanti in lievito di fissione

Summary

Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per mutagenesi casuale di un determinato gene in lievito di fissione. Ad esempio, noi target rpt4 +, che codifica per una subunità del proteasoma 19S e schermo per le mutazioni che destabilizzare eterocromatina.

Abstract

Mutagenesi casuale di geni bersaglio è comunemente usata per identificare le mutazioni che producono il fenotipo desiderato. Dei metodi che possono essere utilizzati per raggiungere mutagenesi casuale, errori PCR è una strategia conveniente ed efficiente per la generazione di un pool di diverso mutanti (i. e., una libreria mutante). Errori PCR è il metodo di scelta quando un ricercatore cerca di mutare una regione pre-definita, come la regione di codificazione di un gene lasciando inalterato altre regioni genomiche. Dopo la libreria mutante è amplificata dalla PCR errori, deve essere clonato in un plasmide adatto. La dimensione della biblioteca generata da errori PCR è limitata dall'efficienza del passaggio clonazione. Tuttavia, il lievito di fissione, Schizosaccharomyces pombe, il clonazione passo possa essere sostituito dall'uso di una fusione altamente efficiente One-Step PCR per generare costrutti per la trasformazione. Mutanti di fenotipi desiderati quindi sono selezionabili utilizzando appropriati ai giornalisti. Qui, descriviamo questa strategia in dettaglio, prendendo come esempio, un reporter inserito all'eterocromatina centromerica.

Introduction

Genetica in avanti è un metodo classico, in cui i ricercatori cercano mutanti naturali che visualizzano un fenotipo particolare ed eseguire analisi genetiche. In genetica inversa, mutazioni vengono introdotti in un gene di interesse ed il fenotipo è esaminato. In quest'ultimo caso, mutagenesi casuale di un gene target viene spesso utilizzata per generare un pool di mutanti che sono successivamente selezionato per desiderata fenotipi, come sensibilità di temperatura o alterati di attività enzimatica. Possono essere utilizzati vari metodi per raggiungere mutagenesi casuale, tra cui errori PCR¹; Di irradiazione UV²; mutagen....

Protocol

1. preparazione dei Media

1. Preparare Estratto di lievito con integratori (Sì), sì senza adenina (Sì basso Ade), Pombe Glutamate media (PMG¹²) e PMG senza adenina (PMG-Ade) mescolando i componenti come descritto nella tabella 1. Sì-Ade (bassa Ade) e piastre PMG-Ade hanno tutti gli stessi componenti, ma l'adenina è omesso da quest'ultimo.
   1. Utilizzare il seguente stock di sale (50x): 52,5 g/L MgCl₂·6H₂O, 2 g/L CaCl₂·2H₂O, 50g/L KCl, 2G/L Na₂modo₄ in acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro di dimensioni dei pori di 0.22-µm e conservare ....

Results

I mutanti di Rpt4 acquisiti seguendo le procedure descritte nella Figura 1 possono essere analizzati valutando i colori delle colonie. I colori delle colonie sono macchiati sulle piastre pertinenti nel fare diminuire il numero delle cellule nella Figura 2. Il reporter ade6 + inserito presso la regione di eterocromatina è messo a tacere nel selvaggio-tipo e Mostra colonie rosse in piastra sì-Ade. Una volta che l'eterocrom.......

Discussion

Mutagenesi casuale tramite PCR errori è un potente strumento per la generazione di un pool di diverso mutanti in una determinata regione. Questa tecnica è particolarmente utile per gli studi che cercano di valutare la funzione di una proteina in una circostanza specifica. Ad esempio, abbiamo utilizzato nel presente documento errori PCR per valutare la funzione della 19S proteasome subunità, Rpt4, nella manutenzione di eterocromatina. Variando la regione mirato dalla PCR errori e regolare le condizioni di selezione, siamo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Media
Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270-10KG
Estratto di lievito	BD Biosciences	212720
L-Leucina	JUNSEI	87070-0310
Adenina solfato	ACR	16363-0250
Uracile	Sigma-Aldrich	U0750
L-Istidina	Sigma-Aldrich	H8125
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1.05108.0050
NaCl	JUNSEI	19015-0350
MgSO4• 7H2O	Sigma-Aldrich	63140
CaCl2	Sigma-Aldrich	12095
Ftalato di potassio	Sigma-Aldrich	P6758-500g
Inositolo	Sigma-Aldrich	I7508-50G
Biotina	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Acido borico	Sigma-Aldrich	B6768-1KG
MnSO4	Sigma-Aldrich	M7634-500G
ZnSO4• 7H2O	JUNSEI	83060-031
FeCl2• 4H2O	KANTO	CB8943686
Molibdato di sodio diidrato	YAKURI	31621
KI	JUNSEI	80090-0301
CuSO4• 5H2O	YAKURI	09605
D-mio-inositolo	MP biomedicals	102052
Pantotenato	YAKURI	26003
Acido nicotinico	Sigma-Aldrich	N4126-500G
(NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Agarosio	Biobasic	D0012
G418, geneticina	LPS	G41805
2. Reazioni enzimatiche
PfuUltra II Fusion HS DNA polimerasi	Aglient	600380	Per mutagenesi sito-specifica
GeneMorphII Kit di mutagenesi casuale	Aglient	200500	Per PCR soggetta a errori
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà	Thermo Fisher	F-530L	Per PCR di fusione
Ex Taq  DNA polimerasi	Takara	RR001b	Per PCR generale
BamH1	New England BioLabs	R0136S
Xho1	New England BioLabs	R0146S
Dpn1	New England BioLabs	R0176S
3. Attrezzatura
Velveteen quadrato, nero	VWR	89033-116	Per replica
Replica-strumento di placcatura	VWR	25395-380	Per replica
MicroPulser Electroporator	Biorad	1652100	Per la trasformazione del lievito di fissione
Cuvette per elettroporazione, fessura 0,2 cm	Biorad	1652086	Per la trasformazione del lievito di fissione
Termociclatore	Bioer	BYQ6078	Per la reazione di rampa della PCR di fusione