Her præsenterer vi en protokol for at generere en 3D organotypic melanom klumpformet hudmodel, der sammenfatter både arkitektur og flercellede kompleksiteten af et orgel/tumor i vivo men samtidig rummer systematisk eksperimentelle intervention.
Maligne transformation af melanocytter, pigment celler i huden, forårsager dannelsen af modermærkekræft, en meget aggressiv kræft med øget metastatisk potentiale. For nylig, mono-kemoterapier fortsat at forbedre af melanom specifikke Kombinationsbehandlinger med målrettede kinase hæmmere. Stadig, metastatisk melanom er en livstruende sygdom, fordi tumorer udstille primære modstand eller udvikle resistens over for nye behandlingsformer, dermed genvinde tumorfremkaldende kapacitet. For at forbedre den terapeutiske succes af malignt melanom, er bestemmelse af molekylære mekanismer giver modstand mod konventionelle behandlingsmetoder nødvendige; Det kræver dog innovative cellulære in vitro- modeller. Her, vi introducere en in vitro- tre-dimensionelle (3D) organotypic melanom klumpformet model der kan skildre i vivo arkitektur af malignt melanom og kan berettige nye indsigter i samhandel tumorsygdomme og tumor-værtssammenspil. Modellen indeholder defineret antal modne og differentieret melanom spheroids i et 3D fuld menneskehud genopbygning model bestående af primære hudceller. Integrerede melanom spheroids cellulære sammensætning og differentiering status er magen til ene af kutane melanom metastaser in vivo. Ved hjælp af denne organotypic melanom klumpformet model, som et stof screening platform kan støtte til identifikation af respondenter at valgt Kombinationsbehandlinger, mens besparende unødvendig behandling byrde for ikke-responders, hvorved fordelene terapeutiske indgreb.
Den menneskelige hud er sammensat af to særskilte rum, der tjener forskellige funktioner i beskytte kroppen mod skadelige miljømæssige virkninger1. Den lavere dermal rum består af en fibro-elastisk bindevæv. Det består af løst forbundne kollagen og elastin fibre syntetiseret af fibroblaster, tjener en mekanisk barriere funktion. Dermis er adskilt fra den øverste epidermis af basal lamina, som fremstilles som en ekstracellulære matrix på grund af en konstant kommunikation mellem begge hud rum. I modsætning til dermis, epidermis er en planocellulære epitel, som hovedsageligt består af keratinocytter og kan opdeles i fire lag. Stratum basale består af udifferentierede basal keratinocytter, som konstant stammer fra hud stamceller stratifying igennem faser af stratum spinosum og stratum granulosum ind stratum corneum at beskytte kroppen fra dehydrering og infektioner2. Melanocytter er justeret på den basale membran og kommunikere gennem dendritiske udvidelser med flere keratinocytter. De producere pigmentet melanin for at beskytte huden væv fra de skadelige virkninger af UV-stråling, som huden ældning, immunsuppression, betændelse og induktion af ikke-melanom hudkræft. UV stråling bidrag til omdannelsen af melanocytter til malignt melanom, er dog stadig under debat3.
Melanom udvikling er differentieret i forskellige tumor progression faser og karakteriseret ved visse genetiske, morfologiske og histologiske ændringer4. De stammer enten de novo eller fra en medfødt eller erhvervet nævus på grund af en lokal forøgelse af melanocyte spredning forårsager godartede neoplasi. Dette forløber læsion kan konvertere til strukturelt ændrede Dysplastiske væv indeholdende atypic celler, som fortsat kan den første maligne fase, radial vækstfase (RGP). Denne tidlige tumor progression fase er karakteriseret af celler radialt prolifererende i epidermis, viser par lokalt invasive celler i papillære dermis. Under den efterfølgende lodret vækst fase (VGP) melanom viser celler allerede en metastatisk og invasive fænotype ved at bryde gennem basal lamina at infiltrere de dybere dele af dermis og subkutane væv5. Endelig, den metastatisk melanom (MM) repræsenterer den mest aggressive progression fase med metastaserende celler systemisk breder sig i hele blod- og lymfeknuder systemet at invadere distalt organer som lever, lunge og hjerne6.
Til dato, er tidlig diagnose efterfulgt af kirurgi stadig den mest effektive behandling af malignt melanom. Prognosen for patienter med Fjern metastase, dog stadig især fattige7, fordi klassisk kemoterapi regimer giver kun lidt overlevelse fordel8,9. Men, efter årtiers stagnation, de seneste fremskridt i målrettede behandlinger er betydeligt forbedret prognosen for malignt melanom.
Dysregulering af to store mitogen aktiveret veje, RAS-RAF-MEK-ERK og PI3K-AKT-PT signaling veje, præsentere centrale drivkræfter for melanom progression, især når constitutively aktivering punktmutationer af protooncogener BRAFV600 og De nationale tilsynsmyndigheder er nuværende10. I overensstemmelse hermed, opfindelsen af målrettede kinase hæmmere lovede terapeutisk fordel for patienter med metastatisk melanom. Et væld af kliniske forsøg, der foretages til dette punkt har ikke opnået væsentlig gavn for patienter med metastatisk melanom. Næsten alle svar er delvis, med en delpopulation af patienter viser primære modstand. Derudover blev erhvervelse af sekundære modstand fører til tilbagefald observeret i fleste af patienterne11,12.
Det bliver klart, at analyse af mutation status alene ikke er tilstrækkeligt til at udvikle de mest potente terapeutisk strategi. Nye hurtige og pålidelige diagnostiske værktøjer er nødvendige for at systematisk registrere og analysere lydhørhed af individuelle kræftceller. Størstedelen af de i øjeblikket foreliggende data om menneskelige melanom er opnået fra todimensionale (2D) melanom cellekulturer. Tumorcellerne, men dyrkes i 3D tillader intercellulære krydstale mellem differentieret kræft celle delpopulationer samt mellem kræftceller og ikke-transformeret omkringliggende værten væv. Derfor ville det være bedst at rekonstruere 3D-miljø hvor melanom udvikles, anvendes som en præklinisk screening model13,14.
Organotypic melanom klumpformet hudmodel indført her warrants nye indsigter for en dybere forståelse af samhandel tumorsygdomme og tumor-vært interaktion, og kan give en avanceret screening platform for at studere molekylære mekanismer af tumor udvikling og terapi modstand i fremtiden.
At sikre bedst fysiologisk og i vivo efterligne betingelser af huden rekonstruerer, kvaliteten af de primære celler er af allerstørste betydning. Som anført ovenfor, juvenil eller prænatale hudceller viser den laveste differentiering grade og er derfor bedst egnet til at generere fuld-tykkelse hud ækvivalenter. Den første mulige kvalitetskontrol er omfanget af dermal sammentrækning på dag 2 efter såning af keratinocytter og equilibrating gel til ekstraordinær generalforsamling (protokollen afsnit 8.2 og 8.3). Dermal geler vil skrumpe mest med den bedste kvalitet af fibroblaster. Også kan integrationen af for få eller for mange fibroblaster forringe dermal sammentrækning og dermed fastgørelse af den epidermale dermal rummet. Dette vil til gengæld kompromittere epidermal differentiering, fordi denne proces kræver en omfattende cross-talk mellem dermal og epidermal celler.
Kvaliteten af primærelementer afhænger også kritisk celle confluency samt passagen af cellerne. Hvis keratinocytter er vokset til ≥80% confluency de straks stoppe prolifererende og begynde at differentiere. Det er derfor vigtigt at kultur dem til 40-70% confluency under passaging og bruge dem ikke senere end passage 3-4. Fibroblaster er mindre følsomme, men bør ikke anvendes senere end passage 4-6. Bemærk også at alle primære celler og cellelinjer bruges til at generere organotypic melanom klumpformet hud modeller er kulturperler fri for antibiotika, og derfor forurening risikoen er høj. Men tilsætning af antibiotika ændrer fysiologi af de enkelte celler og derfor reducerer kvaliteten af huden-ækvivalenter.
Tumordannelse klumpformet er generelt muligt fra næsten alle former for tumor cellelinjer og også fra tumorceller frisk isoleret fra patient materiale. Den første celle nummer og/eller dyrkning tid for at opnå optimal klumpformet størrelser kan variere afhængigt af celletype anvendes. Op til en størrelse på 150-200 µm, kan alle celler i en klumpformet stadig tilstrækkelig leveres med næringsstoffer via simpel diffusion. Kun spheroids med størrelser ≥500 µm viser en høj grad af cellulære differentiering og repræsentere typiske funktioner af ikke-vaskulariserede tumor væv22.
Organotypic melanom-klumpformet-hud-modellen udviklet her er særligt velegnet til at studere tumor-værtssammenspil og for melanom drug test under i vivo-indkvartering vilkår15. Stadig, miljø af melanom i vivo er endnu mere kompleks, husly en bred vifte af tumor forbundet celletyper, herunder immunceller og endotelceller. Da tilsætning af ordentlig primære immunceller står over for problemer med histocompatibility, er disse modeller endnu ikke kunnet følge tilstrækkelig med i immun-terapeutiske tilgange.
Ikke desto mindre melanom spheroids kan genereres fra frisk isoleret patient materiale og når inkluderet i den fulde hud rekonstruere, kan tjene som enkelt drug screening platforme. Selv integrationen af stykker af melanom metastaser i huden rekonstruerer er tænkeligt at teste stoffet kombinationer i en skræddersyet terapeutiske tilgang. Herunder organotypic 3D skin-melanom model i præklinisk afprøvning er tilbøjelige til at hjælpe med at sikre, at de mest lovende nye terapeutiske begreber er taget frem i klinisk afprøvning, dermed reducere nedslidning satsen af potentielle nye behandlinger for dette sygdom og øge hastigheden af terapeutiske succes i kliniske forsøg.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Hanna Voersmann for oprettelse af 3D organotypic melanom-klumpformet-hud-model og giver udmærkede protokoller. Forfatterne også takke Silke Busch for værdifuld teknisk støtte. Arbejdet var støttet af BMBF e: Med programmet “Melanom følsomhed” 031A423A.
fetal serum albumin (FCS) | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | add 10 % to cell culture medium |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 1X dilute in PBS |
RPMI | Thermo Fisher Scientific | 61870010 | for cultivation of melanoma cell lines |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 41965062 | for cultivation of primary fibroblasts |
Dispase | Gibco life technologies | 17105041 | 2U/ml, dissolve in PBS |
Collagen type I | BD Biosciences | 354249 | usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml |
24-well inserts Nunclon | Nunc | 140629 | 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts! |
cell strainer | BD Falcon | 352360 | yellow |
Gentamycine | Thermo Fisher Scientific | 15750060 | dissolve in PBS |
Keralife keratincyte medium | Cell Systems | do not add FCS or antibiotics | |
Collagenase | SERVA | 17454 | NB4 standard grade |
juvenile human keratinocytes | Cell Systems | FC-0007 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
juvenile human fibroblasts | Cell Systems | FC-0001 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamine, [-] L- Pyruvate |
Gibco life technologies | 41965 | mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium; mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium |
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine | Gibco life technologies | 21765-029 | add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15) |
EGF | Gibco life technologies | 13247-051 | add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium |
Calcium chloride | Merck Chemicals | 2381 | add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium |
Selenic acid | Alfa Aesar | 18851 | add 53 nM for the generation of EGM and MM medium |
Insulin | Lilly | HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E-0135 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
P-Ethanolamine | Sigma-Aldrich | P-0503 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
Holo-Transferrine | Sigma-Aldrich | T-0665 | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Triiodthyronine | Sigma-Aldrich | T-6397 | add 20 pM for the generation of EGM and MM medium |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-088816 | add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | add 10 nM only for the generation of EGM medium |
Hepes | Sigma-Aldrich | H-3784 | add 15 mM for the generation of EGM and MM medium |
Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
Cholinchloride | Sigma-Aldrich | C-7017 | add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium |
dFCS | Sigma-Aldrich | F-0392 Lot 086K0361 | add 2 % for the generation of EGM and MM medium |
Adenine | Sigma-Aldrich | A-9795 | add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium |
L-Glutamine | PromoCell | C-42209 | add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium |
Strontiumchloride | Sigma-Aldrich | 255521 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
anti cytokeratin 10 antibody | Dako | M7002 | 1:50 |
anti cytokeratin 14 antibody | Santa Cruz | sc-53253 | 1:200 |
anti laminin 5 antibody | Santa Cruz | sc-32794 | 1:50 |
anti filaggrin antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-13440 | 1:50 |
anti involucrin antibody | Acris Antibodies | AM33368PU | 1:50 |
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled | LifeSpan Biosciences | LS-C153907 | 1:50 |
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled | Jackson Immuno Research | 115-165-003 | 1:1000 |
DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | 1:100 |