Presentiamo un metodo che può fornire ulteriori approfondimenti i primi eventi sottostante neurodegenerazione e basato sulla tecnica del cervello stabilito ex vivo , unendo i vantaggi degli esperimenti in vivo e in vitro . Inoltre, rappresenta un'opportunità unica per un confronto diretto del gruppo trattata e non trattata sullo stesso piano anatomico.
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Articolo metodologico
Un approccio alternativo per studiare eventi primari nella neurodegenerazione utilizzando fettine di cervello di ratto Ex Vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nonostante i numerosi studi che tentano di sviluppare modelli animali affidabile che riflettendo il primario i processi di neurodegenerazione sottostante, molto pochi sono stati ampiamente accettati. Qui, vi proponiamo una nuova procedura adattata dal ben noto ex vivo fetta tecnica del cervello, che offre una più stretta in vivo-come scenario di in vitro i preparativi, per indagare gli eventi precoci innescando la degenerazione delle cellule, come osservato nel morbo di Alzheimer (annuncio). Questa variante è costituita da passi semplici e facilmente riproducibili, che consentono la conservazione della citoarchitettura anatomica della regione del cervello selezionato e la sua funzionalità locali in un ambiente fisiologico. Diverse aree anatomiche possono essere ottenuti dal cervello stesso, offrendo la possibilità di eseguire esperimenti multipli con i trattamenti in questione in un sito - dose- e tempo-dipendente. Limitazioni potenziali che potrebbero influenzare i risultati relazionati a questa metodologia sono legate alla conservazione del tessuto, vale a dire, il mantenimento della sua integrità anatomica durante le operazioni di affettamento e incubazione e lo spessore di sezione, che possono influenzare l'analisi biochimica e immunohistochemical. Questo metodo può essere impiegato per scopi diversi, come esplorare i meccanismi molecolari coinvolti in condizioni fisiologiche o patologiche, screening di farmaci o dosaggi di dose-risposta. Infine, questo protocollo potrebbe anche ridurre il numero di animali impiegati in studi comportamentali. L'applicazione segnalata qui recentemente descritto e testato per la prima volta su ex vivo il fettine di cervello di ratto contenenti proencefalo basale (BF), che è una delle regioni cerebrali colpite principalmente in annuncio. In particolare, è stato dimostrato che la somministrazione di un peptide tossico derivato dal C-terminale dell'acetilcolinesterasi (AChE) potrebbe richiedere un profilo AD-come, innescando, lungo l'asse antero-posteriore del BF, un'espressione differenziale di proteine alterate in annuncio, ad esempio il recettore nicotinico alfa7 (α7-nAChR), fosforilato Tau (p-Tau) e beta amiloide (Aβ).
Introduzione
Annuncio è che una patologia cronica caratterizzata da danno progressivo neurodegenerative che interessano aree differenti del cervello, come la corteccia di entorhinal (CE), BF, ippocampo (HC) e bulbo olfattivo (OB)1,2,3, 4,5. La fine delle fasi di sviluppo AD portare ad un declino conoscitivo progressivo, rendendo questa malattia la più comune forma di demenza, pari circa al 70% di tutti i casi6. Malgrado vasto tentativo di comprendere le fasi iniziali che causano AD, non esiste a....
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Protocollo
Tutti gli studi sugli animali sono stati effettuati nell'ambito di protocolli approvati.
Nota: In questa sezione, la sequenza delle fasi principali eseguite durante la procedura sperimentale e l'intervallo di tempo consigliato è fornito (Figura 1). Inoltre, una descrizione dettagliata del protocollo è completata da un pannello illustrativo, mostrando azioni critiche che vanno dalla rimozione del cervello per omogeneizzazione del tessuto dopo il periodo di incubazione (Figura 2). I dettagli per quanto riguarda i materiali e le istruzioni per costruire l'apparato e la successiva fase....
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Risultati
Il protocollo presentato qui indica che la somministrazione di un peptide tossico, T30, modula in modo sito-dipendente l'espressione di α7-nAChR, p-Tau e Aβ in sezioni contenenti BF (Figura 3A). Il recettore nicotinico Mostra un aumento significativo nella hemislice rostrale-trattati rispetto alla sua controparte di controllo (fetta 1, p = 0.0310) (Figura 3B), mentre la fetta intermedia non rivela alcun cambiamento tra l.......
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Discussione
L'aspetto principale di questo protocollo, basato sulla tecnica del cervello ben consolidata ex vivo , permette di testare in modo sincrono due hemislices speculare, ottenuti sullo stesso piano anatomico, controllo della loro risposta dopo l'applicazione di uno specifico condizione (controllare o trattati); Questo offre quindi un paradigma sperimentale sotto stretto controllato quanto possibile. La possibilità di valutare in un tempo - dose- e site-specific modo diverse sostanze neurochimiche legate al deficit n.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano concorrenti interessi finanziari. Susan A. Greenfield è il fondatore e Presidente di Neuro-Bio Limited, un'azienda privatamente posseduta e detiene azioni della società. Emanuele Brai e Antonella Cogoni sono dipendenti di Neuro-Bio Ltd.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Neuro-Bio Ltd. Vorremmo ringraziare il Dr. Giovanni Ferrati e Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) per i loro commenti e consigli sul manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germania | S7653 | Reagente per la preparazione di aCSF |
| Cloruro di potassio (KCl) | Sigma-Aldrich, Germania | P9333 | Reagente per la preparazione di aCSF |
| Bicarbonato di sodio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germania | S5761 | Reagente per la preparazione di aCSF |
| Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germania | 63138 | Reagente per preparazione di aCSF |
| Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germania | P5655 | Reagente per preparazione di aCSF |
| Sale di Hepes | Sigma-Aldrich, Germania | H7006 | Reagente per preparazione di aCSF |
| Acido di Hepes | Sigma-Aldrich, Germania | H3375 | Reagente per preparazione di aCSF |
| Glucosio | Sigma-Aldrich, Germania | G7528 | Reagente per la preparazione di aCSF |
| Cloruro di calcio disidratato | Sigma-Aldrich, Germania | 223506 | Reagente per la preparazione di aCSF |
| Peptide T30 | Genosphere Biotechnologies, Francia | Peptide derivato da AChE testato | |
| Kit di dissezione chirurgica | World Precision Instruments, USA | Articolo #: MOUSEKIT | Fase di rimozione del cervello |
| Lame | chirurgicheSwann-Morton, Regno Unito | BS 2982 | Fase di rimozione del cervello |
| da filtro | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Preparazione del cervello per l'affettatura |
| Colla | Preparazione del cervello per l'affettatura | ||
| Vibratomo | Leica, Germania | VT1000 S | Spazzole |
| Manipolazione dei tessuti | |||
| Bombola | di ossigenoFase di sezionamento e incubazione | ||
| 1x Soluzione salina tampone fosfato (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Fase di omogeneizzazione |
| Inibitori della fosfatasi | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Fase di omogeneizzazione |
| Inibitori della proteasi | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Fase di omogeneizzazione |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Fase di omogeneizzazione |
| Microcentrifuga | |||
| Pierce 660 nm Saggio delle proteine | Thermo Scientific, USA | 22660 | Concentrazione delle proteine |
Riferimenti
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's diseas....
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Ristampe e permessi
