Maken, testen en het gebruik van kalium-Ion selectieve Microelectrodes in weefsel plakjes van volwassen hersenen
Summary
Kalium ionen bijdragen tot de rustpotentiaal membraan van cellen en extracellulaire K+ concentratie is een cruciale regulator van cellulaire prikkelbaarheid. We beschrijven hoe te maken, te kalibreren en te gebruiken monopolaire K+-selectieve microelectrodes. Deze elektroden, kunt de meting van elektrisch evoked K+ concentratie dynamiek in volwassen hippocampal plakjes.
Abstract
Kalium ionen aanzienlijk bijdragen tot de rustpotentiaal membraan van cellen en extracellulaire K+ concentratie is daarom een belangrijke regulator van de prikkelbaarheid van de cel. Concentraties van extracellulaire K+ beïnvloeden de rust membraan potentiële en cellulaire prikkelbaarheid gewijzigd door een verschuiving van het evenwicht tussen open en gesloten, geïnactiveerd Staten voor spanning afhankelijk van de ionenkanalen die ten grondslag liggen aan de actiepotentiaal Inleiding en geleiding. Vandaar, is het waardevol voor extracellulaire K+ dynamiek in gezondheid en valt bestuurlijk gezien onder zieke rechtstreeks te meten. Hier beschrijven we hoe te maken, te kalibreren en te gebruiken monopolaire K+-selectieve microelectrodes. We ingezet hen in volwassen hippocampal hersenen segmenten voor het meten van de dynamiek van de concentratie elektrisch evoked K+ . Het oordeelkundige gebruik van dergelijke elektroden is een belangrijk onderdeel van de tool-kit nodig te evalueren van de cellulaire en biofysische mechanismen waarmee extracellulaire K+ concentraties in het zenuwstelsel.
Introduction
Kalium-ion concentraties worden strak gereguleerd in de hersenen, en hun schommelingen een krachtige invloed uitoefenen op de rustpotentiaal membraan van alle cellen. In het licht van deze kritische bijdragen is een belangrijk doel van de biologie het bepalen van de cellulaire en biofysische mechanismen die worden gebruikt voor de concentratie van K+ strak te regelen in de extracellulaire ruimte in verschillende organen van het lichaam1 , 2. een belangrijke voorwaarde in deze studies is het vermogen om te K+ concentraties nauwkeurig meten. Hoewel veel onderdelen die tot kalium homeostase in de hersenen in gezonde en zieke staten bijdragen geïdentificeerde3,4,5 geweest, is verdere vooruitgang vertraagd vanwege de gespecialiseerde aard van ion selectieve microelectrodes voorbereiden kalium meting. Micro-elektrode sensoren vertegenwoordigen de gouden standaard voor het meten van K+ concentraties in vitro, in weefsel segmenten en in vivo.
Benaderingen van de nieuwere voor K+ monitoring worden ontwikkeld met behulp van optische sensoren, maar deze een biologisch relevant bereik van K+ -concentraties niet gedetecteerd of niet al volledig in biologische systemen, doorgelicht hebben hoewel eerste resultaten veelbelovende6,7,8te verschijnen. Vergeleken met optische sensoren, zijn microelectrodes fundamenteel beperkt tot een puntbron meting van ionen, hoewel elektrode matrices van de ruimtelijke resolutie9 verbeteren kunnen. Dit artikel richt zich op de sensoren van de single-barreled micro-elektrode voor het toezicht op K+ dynamics.
In dit werk, rapporteren we gedetailleerde stapsgewijze procedures voor het maken van K+ selectieve microelectrodes, met behulp van een valinomycin gebaseerde kalium-ionophore waarmee zeer selectief (104 K+ vouw om het boekje nb+ selectiviteit) K+ verkeer over membranen10. Een natuurlijk voorkomende polypeptide, valinomycin fungeert als een K+ doorlaatbare poriën en vergemakkelijkt de stroom van K+ beneden het elektrochemische gradiënt. Ook beschrijven we hoe ter ijking van de elektroden, hoe te slaan en te gebruiken en tot slot hoe implementeren voor het meten van K+ concentratie dynamiek in acute hippocampal hersenen plakjes van volwassen muizen. Het gebruik van dergelijke elektroden samen met genetisch gemodificeerde muizen dat het gebrek aan specifieke ionenkanalen voorgesteld te reguleren de extracellulaire K+ dynamiek moet onthullen de cellulaire mechanismen die door het zenuwstelsel worden gebruikt om te controleren de ambient concentratie van K + in de extracellulaire milieu.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode die wij hier beschrijven heeft ons om te beoordelen van K+ dynamics in reactie op elektrische stimulatie van Schaffer zekerheden in acute hippocampal plakjes van volwassen muizen toegestaan. Onze methode voor te bereiden K+ ion selectieve microelectrodes is vergelijkbaar met de eerder beschreven procedures12,13,14,15. Deze methode heeft echter voordelen ten opzi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het Khakh lab werd gesteund door de NIH MH104069. De Mody lab werd gesteund door de NIH NS030549. J.C.O. bedankt de NIH T32 Grant(NS058280) voor Training van neurale micro schakelingen.
Materials
| Vibratome | DSK | Microslicer Zero 1 | |
| Mouse: C57BL/6NTac inbred mice | Taconic | Stock#B6 | |
| Microscope | Olympus | BX51 | |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | |
| pCLAMP10.3 | Molecular Devices | n/a | |
| Custom microfil 28G tip | World precision instruments | CMF28G | |
| Tungsten Rod | A-M Systems | 716000 | |
| Bipolar stimulating electrodes | FHC | MX21XEW(T01) | |
| Stimulus isolator | World precision instruments | A365 | |
| Grass S88 Stimulator | Grass Instruments Company | S88 | |
| Borosilicate glass pipettes | World precision instruments | 1B150-4 | |
| A to D board | Digidata 1322A | Axon Instruments | |
| Signal Amplifier | Multiclamp 700A or 700B | Axon Instruments | |
| Headstage | CV-7B Cat 1 | Axon Instruments | |
| Patch computer | Dell | n/a | |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S0751 | |
| D-glucose | Sigma | G7528 | |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| valinomycin | Sigma | V0627-10mg | |
| 1,2-dimethyl-3-nitrobenzene | Sigma | 40870-25ml | |
| Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate | Sigma | 60591-100mg | |
| 5% dimethyldichlorosilane in heptane | Sigma | 85126-5ml | |
| TTX | Cayman Chemical Company | 14964 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1758-500mL | |
| Sucrose | Sigma | S9378-5kg | |
| Pipette Micromanipulator | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | |
| Objective lens | Olympus | PlanAPO 10xW |
Riferimenti
- McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. , 507 (2001).
- Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137 (2015).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington’s disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
- Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502 (2017).
- Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
- Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
- Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
- Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA – Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
- Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
- Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
- Amzica, F., Steriade, M. The functional significance of K-complexes. Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).
- MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
- Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
- Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058 (2015).
- Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
