Desthiobiotin-streptavidina-affinità mediata purificazione delle proteine che interagiscono con RNA nelle cellule di mesotelioma

Summary

Desthiobiotin etichettatura di un sintetico oligo RNA 25 nucleotidi, che contiene un motivo di elemento ricco di adenina (ARE), permette di grippaggio specifico di proteina citosolica sono vincolanti.

Abstract

Lo in vitro RNA-pulldown è ancora largamente utilizzato nei primi passi di protocolli volti ad identificare RNA-binding proteins che riconoscere specifici RNA strutture e motivi. In questo protocollo RNA-pulldown, commercialmente sintetizzato le sonde del RNA sono etichettate con una forma modificata di biotina, desthiobiotin, all'estremità 3' del filamento di RNA, che si lega reversibilmente al streptavidina e permette così di eluizione delle proteine sotto più fisiologico condizioni. il RNA-desthiobiotin è immobilizzato tramite interazione con streptavidina su biglie magnetiche, che vengono utilizzati per abbattere le proteine che interagiscono specificamente con il RNA di interesse. Proteine non denaturate e attive da frazione citosolica delle cellule di mesotelioma sono utilizzate come fonte di proteine. Il metodo qui descritto può essere applicato per rilevare l'interazione tra proteine RNA associazione di note e una sonda 25 nucleotidi (nt) lunga RNA contenente una sequenza di interesse. Questo è utile per completare la caratterizzazione funzionale di stabilizzare o destabilizzare gli elementi presenti nelle molecole di RNA ottenute utilizzando un'analisi di vettore reporter.

Introduction

Espressione genica e il livello finale del prodotto del gene può essere strettamente regolate che interessano la stabilità del mRNA e mRNA traduzione tasso¹. Questi meccanismi di regolazione post-trascrizionali sono esercitati attraverso le interazioni di non codificanti proteine RNA e/o RNA-binding (RBPs) con mRNA mirati. È solitamente la regione non tradotta 3' del mRNA (3' UTR - appartenendo alla parte non codificante del genoma²) che contiene specifiche cis-elementi regolatori (CRE), che sono riconosciuti da trans-in qualità di fattori quali miRNA o RBPs ³. la migliore studia....

Protocol

1. preparazione di frazione delle proteine citosoliche e nucleari

1. Piatto 4 x 10⁶ ACC-MESO-4 cellule in un matraccio di cultura cellulare T150 coltivate in RPMI - 1640 medio completati con 10% FBS, 1 x penicillina/streptomicina (100x) e 2 mM L-Glutammina (200 mM). Quando le cellule raggiungono una confluenza di 80-90% (~5-5.5 x 10⁶ cellule), procedere con estrazione della proteina della frazione citosolica e nucleare.
   Nota: ACC-MESO-4 linea cellulare è stata ottenuta dal RIKEN BioResource centro¹¹.
2. Medio di aspirare, lavare le cellule con l'aggiunta di 15 mL di PBS 1X, inclinare il piatto delicatament....

Results

In questo esperimento, un frammento lungo 25-nt di calretinin 3' UTR harboring sono motivo (CALB2 3' UTR (ARE) 25-nt) è stato utilizzato per verificare se si lega specificamente alla proteina umana-antigene R (HuR), un noto stabilizzatore di mRNA. Per verificare la specificità dell'elemento sono, un RNA 25-nt sonda CALB2 3' UTR (mtARE) contenente una mutazione sono-motivo, che precedentemente è stata indicata ad abolire l'effetto di stabilizzazione del motivo sono, era usato

Discussion

3' UTR appartengono al genoma non codificante³e tutti gli RNA non codificanti possa interagire con proteine al fine di esercitare la loro funzione⁷. Quando il genoma dei mammiferi è stato trovato per essere trascritto pervasively e prodotto una porzione significativa di lunghi non codificanti RNA¹⁶, emergenti evidenze hanno dimostrato che questi RNA non codificante lungo funzionano nella regolazione dell'espressione genica come essi interagiscono con.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NE-PER Kit di estrazione nucleare e citoplasmatica	Thermo Fisher Scientific	78833
Compresse di inibitori della proteasi Pierce, senza EDTA	Thermo Fisher Scientific	A32965
dosaggio delle proteine BCA Pierce	Thermo Fisher Scientific	23225
Kit di pull-down per proteine RNA magnetiche Pierce.	Thermo Fisher Scientific	20164	Include perline magnetiche e quindi il kit deve essere conservato a 4 gradi C
Perfora l'RNA 3' Kit di destiobitinilazione fine	Thermo Fisher Scientific	20163	Il kit fa parte del "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" e deve essere conservato a -20 gradi C a differenza del kit a scomparsa (4 ° C).
DynaMag-2, supporto magnetico	Thermo Fisher Scientific	12321D
Anticorpo monoclonale Anti - HuR (MOUSE)	Thermo Fisher		Scientific-L'anticorpo è incluso nel kit di pull-down della proteina RNA magnetica Pierce  - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - anticorpo secondario anti-topo di coniglio 1:10.000 in 5% BSA 1x TTBS
Anticorpo monoclonale Anti - &α - tubulina (MOUSE)	Santa Cruz	8035	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - anticorpo secondario anti-topo di coniglio 1:10.000 in 5% BSA 1x TTBS
Anticorpo policlonale anti-PARP (RABBIT)	Segnalazione cellulare	9542	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - anticorpo secondario anti-coniglio di capra 1:10.000 in 5% BSA 1x TTBS
Anticorpo monoclonale anti - mesotelina (MOUSE)	Rockland	200-301-A87
Anticorpo secondario di capra anti-coniglio	Segnalazione cellulare	7074
Anticorpo secondario anti-topo di coniglio	Sigma-Aldrich	A-9044
RPMI - 1640 medio	Sigma-Aldrich	R8758
FBS - Siero bovino filtrato	Pan Biotech	P40-37500
Penicillina - streptomicina (100x)	Sigma-Aldrich	P4333
Soluzione di L-Glutammina (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0,25% tripsina-EDTA (1x)	Gibco di Life technologies	25200-056
Mini-PROTEAN 3 celle	Bio-Rad	1653301
Mini Protean System Lastre di vetro	Bio-Rad	1653308
Mini-PROTEAN con distanziatore integrato da 1,5 mm	Pettine Bio-Rad	1653312
Mini-PROTEAN, 10 pozzetti, 1,5 mm, 66 &; L	Bio-Rad	1653365
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Moduli	Bio-Rad	1658050
RNaseZap Soluzione di decontaminazione della RNasi	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Rotiphorese gel 30 - soluzione stock acquosa al 30% di acrilammide e bisacrilammide a una razione di 37,5:1	Roth	3029
20% SDS	PanReac AppliChem	A3942
	Perkin Elmer	NEF1002	Deve essere attivato incubando in metanolo puro per 1 minuto seguito da lavaggio in acqua per 2 minuti.
Cella di trasferimento semi-secca Trans-Blot SD	Substrato ECL occidentale Bio-Rad	1703940
Clarity	Bio-Rad	1705061
FusionFX  Digital Imager	Vilber-RNA
oligosintesi	Mycrosynth AG,	Svizzera-la	scala di sintesi - 0,04 µ mol -
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A7030
Acido cloridrico (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	182883.1211
Ultra puro 1 M Tris, pH 7,5	Thermo Fisher Scientific 15567027
glicerolo	Aliquote sterili Thermo Fisher Scientific	17904	da conservare a -20 gradi C
Pierce Streptavidin perline magnetiche	Thermo Fisher Scientific	88817	Si prega di notare che queste perle magnetiche hanno un diametro medio di 1 & micro; m (intervallo da 0,5 a 1,5 µ m). Inoltre, Dynabeads-M280 Streptavidin, che sono perle di dimensione omogenea 2,8 & micro; m, sono utilizzati anche nell'RNA-pulldown, ma tieni presente che ciò può influenzare il processo di purificazione.
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Persolfato di ammonio	Sigma-Aldrich	A3678
Coomassie G-250	Applichem	A3480
Solfato di alluminio-(14-18)-idrato	Sigma-Aldrich	368458
acido orto-fosforico	Applichem	A0637