Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines
Summary
Nous présentons ici une méthode pour l’ingénieur le génome de c. elegans en utilisant CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines et modèles de réparation dépendant d’homologie.
Abstract
Les répétitions de palindromes régulièrement intercalées en cluster (CRISPR) – CRISPR – protéine 9 (Cas9) système de défense immunitaire adaptative procaryotes a été coopté comme un outil puissant pour l’ingénierie des génomes eucaryotes précise associée. Nous présentons ici une méthode rapide et simple à l’aide de guide unique chimérique RNAs (sgRNA) et CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines (RNP) pour la production efficace et précise de génomique des mutations ponctuelles chez c. elegans. Nous décrivons un pipeline pour sélection cible sgRNA, conception de modèle de réparation axés sur l’homologie (HDR), complexants CRISPR-Cas9-RNP et livraison et une stratégie de génotypage permettant l’identification rapide et fiable des animaux correctement édité. Notre approche non seulement permet la génération facile et l’identification du point désiré de génomique des animaux mutants, mais facilite également la détection d’autres allèles indel complexe en environ 4-5 jours avec un rendement élevé et une charge de travail réduite.
Introduction
Les progrès technologiques récents ont radicalement transformé et accéléré la capacité à précisément les génomes ingénieur. En particulier, le système CRISPR-Cas9, qui repose sur l’endonucléase guidée RNA Cas9 pour induire une rupture double brin (DSB) près de la séquence cible des intérêts, a été largement utilisé à l’ingénieur avec précision le génome de la plupart des organismes modèles utilisés en recherche biomédicale1,2,3,4. Significativement, l’utilisation de CRISPR-Cas9 a débloqué génome édition même en difficiles espèces comme c. elegans5. Peu importe l’espèce, générant des mutations ponctuelles avec le génome CRISPR-Cas9 basé système d’édition s’appuie sur trois éléments de base : 1) Cas9 endonucléase, 2) un seul guide d’ARN (sgRNA) qui dirige l’endonucléase Cas9 à une séquence cible et 3) un utilisateur conçu modèle de réparation axés sur l’homologie (HDR) contenant l’edit(s) désiré d’intérêt2.
Il existe plusieurs méthodes qui peuvent servir à introduire le ciblage sgRNA et Cas9 nucléase dans les cellules, y compris le plasmide, d’ARN et de méthodes de prestation virale6. Récemment, livraison directe de pre-complexé sgRNA-Cas9 ribonucléoprotéines (RNP) a émergé comme un outil puissant et efficace dans le génome CRISPR dotés de Cas9 édition7. La prestation directe de pre-complexé CRISPR-Cas9 RNP a plusieurs avantages distincts, à savoir : 1) RNP contourner la nécessité pour la transcription cellulaire et de traduction, RNP 2) sont rapidement éliminé, ce qui peut augmenter la spécificité en réduisant le temps disponible pour hors-cible clivage et 3) RNP ne contenir aucun élément d’ADN/ARN étranger qui contourne l’introduction des séquences non indigènes dans le génome hôte grâce à l’intégration au hasard. Ensemble, ces attributs susceptibles de fournissent une courte rafale de sur-cible CRISPR édition tout en minimisant les effets hors cible.
Les auteurs décrivent un protocole simple et efficace pour introduire des changements génomiques chez c. elegans. Ce protocole comprend ciblage sgRNA et unique oligonucléotide échoués (ssODN) HDR modèle conception, complexants RNP sgRNA-Cas9 et livraison et une stratégie de génotypage pour l’identification sans équivoque des animaux bien édité. En utilisant cette stratégie, non seulement les modifications spécifiques souhaitées peuvent être récupérées, mais autres mutations non-spécifiques indel peuvent aussi être récupérées. Ainsi, notre stratégie permet la génération d’une série allélique à l’aide d’une stratégie unique, où les deux allèles mono, bi-alléliques et indel mutants peuvent être générés dans la génération de1 F.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le système CRISPR-Cas9 est un outil puissant et efficace pour justement modifier le génome d’organismes modèles. Ici, nous démontrons que chimérique sgRNAs20 couplé avec ssODN HDR modèles permettent la génération très efficace de génomique des mutations ponctuelles chez c. elegans. Ce qui est important, nous démontrons que livraison RNP produit haute efficacité édition lorsque la fluorescence est utilisé comme marqueur de sélection Co, mettant en évidence la facilité e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il n’y a aucun conflit d’intérêt concernant ce rapport.
Materials
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
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