빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한
Summary
여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.
Abstract
클러스터 된 정기적으로 산재 된 구조 반복 (CRISPR)-CRISPR-관련 단백질 9 (Cas9) 간결한 적응 면역 방어 시스템을 공동 정확한 진 핵 게놈 엔지니어링에 대 한 강력한 도구로 선택한 되었습니다. 여기, 선물이 C. 선 충의 게놈 포인트 돌연변이 들의 효율적이 고 정확한 세대에 대 한 공상 단일 가이드 RNAs (sgRNA)와 CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs)를 사용 하 여 신속 하 고 간단한 방법. 우리는 sgRNA 대상 선택, 호몰로지 감독 수리 (HDR) 템플릿 디자인, CRISPR-Cas9-RNP complexing 및 배달 및 올바르게 편집된 동물의 강력 하 고 급속 한 식별 수 있도록 유전형 전략 파이프라인을 설명 합니다. 우리의 접근 허용 손쉬운 생성 및 원하는 게놈 포인트의 돌연변이 동물, 뿐만 아니라 또한 높은 효율성 및 감소 된 심사 작업 약 4-5 일에 다른 복잡 한 indel 대립 유전자의 탐지를 용이 하 게 한다.
Introduction
최근의 기술 진보 근본적으로 변형 하 고 정확 하 게 엔지니어 유전자 수를 가속. 특히, RNA 기반 endonuclease 관심의 대상 시퀀스 근처 두 배 물가 틈 (DSB)를 유도 하는 Cas9에 의존 하는, CRISPR-Cas9 시스템을 광범위 하 게 사용 되었습니다 정확 하 게 대부분에 사용 되는 모델 생물의 게놈 엔지니어링 생물 의학 연구1,2,,34. 크게, CRISPR-Cas9를 사용 하 여 게놈 C. 선 충5같은 어려운 종에도 편집 잠금을 해제 했다. 종에 세 가지 핵심 구성 요소에 의존 편집 시스템 CRISPR-Cas9 기반으로 게놈으로 포인트 돌연변이 생성: 1) Cas9 endonuclease, 대상 시퀀스와 설계 3)는 사용자에 게 Cas9 endonuclease 지휘 2)는 하나의 가이드 RNA (sgRNA) 관심2의 원하는 개의 편집 항목을 포함 하는 homology 감독 수리 (HDR) 템플릿.
대상 sgRNA 및 Cas9를 소개 하는 데 사용할 수 있는 여러 방법이 있다 nuclease 플라스 미드, RNA, 그리고 바이러스 성 기반 배달 방법6을 포함 하 여 셀에. 최근, 사전 complexed sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs)의 직접 배달 CRISPR-Cas9-기반 게놈7편집에 강력 하 고 효율적인 도구로 떠오르고 있다. 사전 complexed CRISPR Cas9 RNPs의 직접 배달 여러 가지 이점이 있다, 즉: RNPs 1) 세포 녹음 방송에 대 한 필요를 무시 하 고 번역, 2) RNPs는 급속 하 게 삭제는 사용할 수 있는 시간을 줄임으로써 특이성을 증가 시킬 수 있습니다 오프-대상 분열, 그리고 3) circumvents 아닌 임의의 통합을 통해 호스트 게놈 시퀀스의 소개는 아무 외국 DNA/RNA 요소를 포함 하는 RNPs. 함께, 이러한 특성 가능성이 대상에 CRISPR에서 대상 효과 최소화 하면서 편집의 짧은 버스트를 제공 합니다.
C. 선 충에서 사이트별 게놈 변화를 도입에 대 한 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 sgRNA 및 단일 좌초 oligonucleotide (ssODN) HDR 서식 파일 디자인, sgRNA-Cas9 RNP complexing 및 납품, 및 제대로 편집된 동물의 명확한 식별을 위해 유전형 전략 대상으로 포함 되어 있습니다. 이 전략을 사용 하 여, 원하는 사이트 변경 내용을 복구할 수 있습니다, 뿐만 아니라 다른 일반적인 indel 돌연변이 복구할 수 있습니다. 따라서, 모노-유전자, bi-유전자, 어디 하나의 전략을 사용 하 여 유전자 시리즈의 생성을 허용 하는 우리의 전략 그리고 indel 돌연변이 F1 세대에서 생성 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR-Cas9 시스템 모델 생물의 게놈을 정확 하 게 수정에 대 한 강력 하 고 효과적인 도구입니다. 여기, 우리는 그 공상 sgRNAs20 ssODN HDR 템플릿 사용 C. 선 충게놈 점 돌연변이의 고효율 세대 결합 보여 줍니다. 중요 한 것은, 시연 RNP 배달에 편집 고효율 생산 형광 공동 선택 마커로 사용할 때 편리 함과 기술의 안정성을 강조 합니다.
C. 선 충 게놈 엔…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 보고서에 관련 된 충돌의 관심을 확인 하 고 있습니다.
Materials
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
Riferimenti
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