تحليل توبرينتينج "الترجمة بدء تشكيل معقدة" في مرناس الثدييات
Summary
توبرينتينج يهدف إلى قياس القدرة في المختبر نسخها الجيش الملكي النيبالي لنموذج المجمعات بدء الترجمة مع ريبوسوم تحت ظروف متنوعة. هذا البروتوكول وصف أسلوب للثدييات الجيش الملكي النيبالي توبرينتينج ويمكن استخدامها لدراسة الترجمة تعتمد على عملية النداءات الموحدة ويحركها إيريس.
Abstract
بدء الترجمة خطوة الحد من معدل تخليق البروتين ويمثل إحدى نقاط رئيسية التي تنظم الخلايا على إنتاج البروتين. التنظيم تخليق البروتين هو مفتاح الاستجابة الخلوية للإجهاد، والتقلبات المركزية للعديد من الدول الأمراض، مثل السرطان. على سبيل المثال، على الرغم من أن الإجهاد الخلوي يؤدي إلى تثبيط الترجمة العالمية المخففة كاب-تعتمد على الشروع، تترجم بعض البروتينات الاستجابة للإجهاد بشكل انتقائي بطريقة مستقلة عن عملية النداءات الموحدة. العناصر التنظيمية سرية الجيش الملكي النيبالي، مثل مواقع دخول الريبوسوم الداخلية الخلوية (إيريسيس)، تسمح لترجمة هذه مرناس محددة. تم تحديد هذه مرناس، وتوصيف آلياتها التنظيمية، مجالاً رئيسيا في البيولوجيا الجزيئية. توبرينتينج أسلوب لدراسة بنية الحمض النووي الريبي ووظيفة فيما يتعلق بالشروع في الترجمة. وهدف توبرينتينج لتقييم القدرة في المختبر نسخها من الحمض النووي الريبي تشكيل مجمعات مستقرة مع ريبوسوم تحت مجموعة متنوعة من الظروف، بهدف تحديد تسلسل أو العناصر الهيكلية التبعي العوامل التي تشترك في الريبوسوم ملزمة – مؤشر قبل بدء الترجمة الفعالة. جنبا إلى جنب مع أساليب أخرى، مثل تحليل الغربية والتنميط polysome، يسمح توبرينتينج لوصف قوي لآليات لتنظيم بدء الترجمة.
Introduction
كما الترجمة يستهلك الطاقة الخلوية أكثر، فمن المنطقي أن الترجمة هي محكم التنظيم1. على العكس من ذلك، من التقلبات للترجمة-والتعديلات اللاحقة في إنتاج البروتين-كثيرا ما يلاحظ في الدول الاستجابة للإجهاد والأمراض، مثل السرطان1،2. وميزة رئيسية لمراقبة متعدية الجنسيات هو السرعة التي يمكن أن يغير خلايا إنتاج البروتين من أجل الاستجابة لمختلف المحفزات3. وهكذا يمثل التنظيم الترجمة إليه هامة التي يمكن أن تؤثر على بقاء الخلية والموت1،،من23. خطوات الترجمة، هو البدء بدرجة عالية من التنظيم والمعقدة معظم3. بإيجاز، مرناس الأكثر حقيقية النواة تحتوي على cap7ز م 5 ‘ ضروري دائماً تقريبا لترجمتها. يتطلب الشروع في كاب-تعتمد على بدء التوكسينات العوامل eIF4E، و eIF4A، و eIF4G (كاب-الاعتراف بالمجمع) للتفاعل مع نهاية 5 ‘ مرناً. 43S بريينيتييشن الريبوسوم المعقدة، التي تتضمن البادئ eIF2 زمنياً الحمض الريبي النووي النقال و eIF3، يتم تجنيده لنهاية 5 ‘ مرناً عن طريق تفاعل eIF4G مع eIF3. بريينيتييشن معقدة ويعتقد أن تفحص مرناً، بمساعدة eIF4A (الجيش الملكي النيبالي هيليكاز) حتى يقع كودون ابدأ (أغسطس). بدء 48S المعقدة هو شكلت لاحقاً ويتم تسليم الحمض الريبي النووي النقال في الرتبة فموقع الريبوسوم. أخيرا، متحدون مفارز الريبوسوم 40S و 60S تشكل بدء 80S المعقدة، تليها الترجمة الاستطالة1،،من34. وفي المقابل، تجاوز مواقع دخول الريبوسوم الداخلية (إيريسيس) شرط لسقف 5 ‘ بتجنيد الوحيدات ريبوسومال 40S مباشرة إلى كودون الشروع في3. تخفيف ظروف الإجهاد الفسيولوجية العالمية مرناً الترجمة بسبب تعديلات عوامل الرئيسية العامة بدء حقيقية النواة (ايفس). بيد أن الترجمة غير متعارف عليه الشروع في آليات تسمح بترجمة الانتقائي لبعض مرناس التي غالباً ما ترميز البروتينات الاستجابة للإجهاد وتورط التقلبات لبدء الترجمة غير متعارف عليه في الحالات المرضية مثل السرطان 1 , 2-العناصر التنظيمية “سرية الجيش الملكي النيبالي”، مثل إيريسيس الخلوية، تسمح لترجمة هذه2،مرناس3.
أحد جوانب مثيرة للاهتمام لا سيما مراقبة متعدية فهم آليات متعارف عليه مقابل الترجمة غير المقبول من مرناً معين. توبرينتينج هو أسلوب الذي يسمح آليا إلى الدراسة التفصيلية لبدء الترجمة محددة الكشف في المختبر. والهدف العام من توبرينتينج لتقييم قدرة الحمض النووي الريبي للفائدة على نوكليتي تشكيل بدء الترجمة المعقدة مع الريبوسوم تحت مجموعة متنوعة من الظروف، من أجل تحديد تسلسل، والعناصر الهيكلية، أو الملحقات عوامل مطلوبة من أجل الشروع في ترجمة تتسم بالكفاءة. على سبيل المثال، قد أعاق في غياب سقف 5 ‘ تجنيد الريبوسوم لكن يحفزه وجود آيريس.
ومبدأ هذه التقنية إلى في المختبر نسخ الحمض النووي الريبي للفائدة، احتضان ذلك حضور مقتطفات الخلوية التي تحتوي على مكونات الترجمة (أو مكونات المنقي) للسماح بالشروع في مجمعات للنموذج، وعكس نسخ الجيش الملكي النيبالي بكتاب معين. سوف يتسبب مستقرة الجيش الملكي النيبالي-الريبوسوم مجمعات النسخ العكسي المماطلة على حافة 3 ‘6،75،الريبوسوم، ما يسمى’ توبرينت ‘.
في هذا البروتوكول ومفارز ريبوسومال، ايفس، ترنس وايريس ترانس-العوامل بالنيابة (إيتافس) هي أسهم مريح بأرنب خلية شبكية ليستي (ررل). وهناك ميزة أخرى لهذا البروتوكول هو استخدام تمهيدي المسمى فلوريسسينتلي وتصوير المستندة إلى جل الأسفار، بدلاً من كتاب راديولابيليد. وهذا يلغي خطوات إضافية، بما في ذلك راديولابيلينج التمهيدي، فضلا عن تجفيف الجل ويعرضها على شاشة تكثيف. تسجل العصابات الفلورسنت في الوقت الحقيقي، كما يدير هلام، مما يسمح للقرار أكبر. لم يسبق لهم اللعب المانع مرتبطة بالعاشر من البروتين (شياب) المبرمج آيريس رنا كمثال هنا، على الرغم من أن يمكن أيضا أن تحلل مرناس توج بهذا الأسلوب8.
على عكس التحليل الغربي، الذي يقيس الناتج النهائي لعملية الترجمة في الخلية ليساتيس، توبرينتينج نهج في المختبر لقياس الترجمة بدء تشكيل معقدة في الجيش الملكي النيبالي. يسمح هذا النهج التخفيضي لدراسة مفصلة للغاية من ركائز أو العوامل التي تنظم الشروع في ترجمة (على سبيل المثال-، توج أو الأمم المتحدة توج مرناً، إيريس الهيكل، ووجود أو عدم وجود الذيل بولي-أ، وتوفير عوامل محددة من البروتين، إلخ.). ومن ثم، يمكن استخدام توبرينتينج لدراسة أوضاع مختلفة للترجمة8 أو آثار هياكل مرناً، مثل إيريسيس، في البروتين التوليف9،10.
Protocol
Representative Results
Discussion
توبرينتينج تقنية قوية لقياس قدرة الحمض النووي الريبي للفائدة لدعم تشكيل مجمعات بدء الترجمة تحت ظروف درجة عالية من التحكم مباشرة. هذا البروتوكول وصف تقنية مبسطة توبرينتينج الكشف الثدييات. أرنب خلية شبكية ليستي (ررل) يستخدم كمصدر مناسب ريبوسوم، ايفس، البادئ الحمض الريبي النووي النقال، واي…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل علوم الطبيعية والهندسة المجلس من كندا-اكتشاف “منحة بحثية” (رجبين-2017-05463)، و “المؤسسة الكندية” للابتكار-جون ر. إيفانز قادة الصندوق (35017) وبرنامج يبتكر ألبرتا للحرم الجامعي ووزارة ألبرتا التنمية الاقتصادية والتجارة.
Materials
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
Riferimenti
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5′-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
